Se presenta un método para medir la velocidad del flujo sanguíneo microcirculatorio en metástasis de cáncer pulmonar de la superficie pleural en ratas de forma automatizada, utilizando microscopía intravital pulmonar a tórax cerrado. Este modelo tiene potencial para ser utilizado como una herramienta generalizada para realizar investigaciones fisiológicas sobre metástasis pulmonares en roedores.
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Artículo de método
Medición Automatizada de la microcirculación de la sangre Velocidad del caudal en metástasis pulmonar de ratas
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Resumen
Resumen
Debido a que el pulmón es un órgano objetivo importante de la enfermedad metastásica, los modelos animales para estudiar la fisiología de las metástasis pulmonares son de gran importancia. Sin embargo, hasta la fecha existen muy pocos métodos para investigar las metástasis pulmonares de forma dinámica a nivel microcirculatorio, debido a la dificultad de acceder al pulmón con un microscopio. Aquí, se presenta un método de microscopía intravital para obtener imágenes funcionales y cuantificar la microcirculación de metástasis pulmonares superficiales en ratas, utilizando una ventana pulmonar de tórax cerrado y un análisis automatizado de la velocidad y dirección del flujo sanguíneo. Se demuestra la utilidad de este método para medir los aumentos en la velocidad del flujo sanguíneo en respuesta a la intervención farmacológica y para obtener imágenes de la conocida vasculatura tortuosa de los tumores sólidos. Esta es la primera demostración de microscopía intravital en metástasis pulmonares en un modelo de tórax cerrado. Debido a su minimización de la invasión, así como a su relativa facilidad y practicidad, esta tecnología tiene el potencial de experimentar un uso generalizado en los laboratorios que se especializan en la investigación de tumores pulmonares.
Introducción
El pulmón es uno de los órganos diana más importantes de la enfermedad metastásica, y debido a que esta afección es difícil de tratar con éxito con quimioterapia y radioterapia, la cura sigue siendo rara1,2. Las características fisiopatológicas y microcirculatorias específicas de los tumores sólidos primarios y metastásicos, como la hipoxia microrregional, la limitación de la difusión y la vasculatura tumoral ineficiente, contribuyen en gran medida a su resistencia al tratamiento anticanceroso3,4. Debido a la escala microscópica y a la naturaleza dinámica de parámetros como el flujo sanguíneo microvascular, la microscopía intravital del tumor en ....
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Protocolo
NOTA: Todos los procedimientos relacionados con los animales descritos en este protocolo han sido previamente aprobado por el animal de Atención Institucional y el empleo Comisión de la Universidad de Duke (DUIACUC).
Cultivo Celular y Inyección 1. Cáncer
- Cultivar las células cancerígenas metastásicas marcados con fluorescencia (por ejemplo, células de cáncer de mama MDAMB231-GFP humanos, regalo del doctor Patricia Steeg, NCI, y las células del sarcoma de ratón marcado con YFP, regalo del doctor David Kirsch, Duke University Medical Center, Departamento de Oncología Radioterápica) en medio de cultivo adecuado (por e....
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Resultados
La vasculatura en tumores sólidos se sabe que difieren significativamente de suministro normal de sangre, mostrando un mayor grado de tortuosidad y mayores distancias intervasculares 13. En consecuencia, las pistas del flujo sanguíneo en metástasis de cáncer de mama y el sarcoma pulmonar experimental tienen formas irregulares y grandes lagunas intervasculares (Figura 2A, dos paneles inferiores) cuando se compara con la microcirculación pulmonar normal (Figura 2A, panel superi.......
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Discusión
Se presenta un modelo que es factible cambios de imagen en el flujo sanguíneo en la microcirculación y otros procesos dinámicos en las metástasis pulmonares de ratas, usando microscopía intravital y análisis de flujo de sangre computacional. Si bien existen otros métodos para llevar a cabo la microscopía en pulmones expuestos en ribcages abiertos de los roedores, este modelo también es la primera imagen de metástasis pulmonares a través de una perforación de la pared del pecho en un entorno de pecho cerrado. Usando este.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Se agradece el consejo científico de los Dres. Timothy McMahon y Siqing Shan. Los presentadores agradecen a los Dres. David Kirsch y Patricia Steeg por el generoso regalo de las células de sarcoma de ratón y MDAMB-231 metastásicos marcadas con fluorescencia, respectivamente. Este trabajo fue financiado en parte por la Agencia de Proyectos de Investigación Avanzada de Defensa de los Estados Unidos (DARPA, por sus siglas en inglés) con el número de premio N66001-10-C-2134, y en parte por el Departamento de Oncología Radioterápica del Centro Médico de la Universidad de Duke.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Ratas desnudas atímicas | Charles | River Código de cepa 316 | Ratas desnudas atímicas hembras de 10 semanas de edad |
| micro-CT/micro-Irradiador | Rayos X de precisión Inc. | Xrad 225Cx | Utilice MicroCT para detectar metástasis |
| DiI (1,1 = -dioctadecil-3,3,3 = ,3 = perclorato de tetrametil-indocarbocianina) | Sigma Aldrich | 468495-100MG | Mezcle 100 μl de glóbulos rojos empaquetados con 100 ul de 0,5 mg/ml de DiI en etanol de 200 grados, 2 ml de solución de dextrosa al 5% en agua y llene hasta un volumen final de 10 ml con solución salina |
| Ventilador para roedores | Kent Scientific | TOPO Ventilador | para animales pequeñosEl dispositivo es importante para mantener la presión pulmonar positiva después de la aplicación de neumotórax |
| Microscopio de fluorescencia Zeiss Axioskop vertical | Microscopio Zeiss | Axioskop | para imágenes intravitales |
| Cámara CCD Andor Cámara CCD | Andor | iXonEM 885 | para imágenes en vivo del flujo sanguíneo |
| Oxímetro de pulso | StarrLife | MouseOx | Oxímetro de pulso |
| Microscopio | de fluorescenciaMicroscopio de fluorescencia Zeiss | Axioskop |
Referencias
- Billingsley, K. G., et al. Pulmonary metastases from soft tissue sarcoma: analysis of patterns of diseases and postmetastasis survival. Ann Surg. 229, 602-610 (1999).
- Rashid, O. M., Takabe, K. The evolution of the ro....
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Reimpresiones y permisos
