SILAC immunoprecipitation eksperimenter representerer et kraftig middel for å oppdage romanen protein: protein interaksjoner. Ved å la den nøyaktige relative kvantifisering av protein overflod i både kontroll-og testprøver, sanne interaksjoner kan lett skilles fra eksperimentelle forurensninger, og en lav affinitet interaksjoner konservert ved bruk av mindre strenge bufferbetingelser.
Kvantitative proteomikk kombinert med immuno-affinitetsrensing, SILAC immunoprecipitation, representerer et kraftig middel for oppdagelsen av romanen protein: protein interaksjoner. Ved å la den nøyaktige relative kvantifisering av protein overflod i både kontroll-og testprøver, kan virke interaksjoner lett kan skilles fra eksperimentelle forurensninger. Lav-affinitets interaksjoner kan bli bevart ved bruk av mindre strenge bufferbetingelser og være lett identifiserbare. Denne protokollen beskriver merking av vevskultur-celler med stabil isotop merkede aminosyrer, transfeksjon og immunoutfelling av en affinitet kodede protein av interesse, etterfulgt av fremstilling for tilførsel til en massespektrometri anlegg. Denne protokollen deretter drøfter hvordan å analysere og tolke dataene som returneres fra massespektrometer for å identifisere cellulære partnere i samspill med et protein av interesse. Som et eksempel på denne teknikken er brukt på idensere proteiner binding til de eukaryote oversettelse initiering faktorer: eIF4AI og eIF4AII.
Et viktig skritt i å forstå protein funksjonen er identifikasjon av relevante samspill proteiner. Når slike proteiner er ukjent det finnes en rekke teknikker som er tilgjengelige, hver med sine egne fordeler og ulemper. Disse inkluderer gjær to-hybrid system, mater assays ved å bruke rekombinant protein, så vel som tandem affinitetsrensing eller TAP-merking 1, 2.
En nyere tillegg til disse teknikker er en kombinasjon av affinitets-rensing av et protein av interesse fra en relevant pattedyrcellelinje, etterfulgt av kvantitativ massespektrometri ved hjelp av stabile isotop merking av aminosyrer i cellekultur (SILAC) 3. Dette har fordeler i forhold til gjær to-hybrid tilnærming ved at celle lokalisering og post-translasjonelle modifikasjoner er ikke perturbert, så vel som fordeler fremfor tradisjonelle TAP-merking ved at den er en kvantitativ snarere enn kvalitativ metode som tillater brukeren å readily skille ikke-spesifikt samspill proteiner og forurensninger, fra vertsfaktorer som binder spesifikt. Videre, som et eksempel er vanligvis analysert helhet, heller enn som individuelle proteinbånd, proteiner av interesse ikke er maskert av tilsvar migrere proteiner på en gel, og heller ikke har de vanligvis være til stede i tilstrekkelige nivåer for å være synlig etter fargingen, noe som fører til økt antall selvsikkert identifiserte proteiner fire.
For å demonstrere denne teknikken, GFP fusjon av det nært beslektede eukaryote oversettelse initiering faktor eIF4AI og eIF4AII at andelen over 90% aminosyre identitet ble undersøkt av SILAC-immunoprecipitation kvantitative proteomikk. Humant eIF4AI og II ble klonet inn i pEGFP-C1 til å danne et fusjonsprotein hvor GFP er fusjonert til N-terminus av eIF4A. For å unngå behovet for å generere stabile cellelinjer transient transfeksjon ble brukt til å levere disse konstruerer til stabile isotopen merket 293T celler.
<p class="Jove_content"> Celler ble først merket i to uker i SILAC cellekulturmedier, etterfulgt av transfeksjon av plasmid-DNA som koder for et protein av interesse. Celler ble deretter lysert, proteinkonsentrasjonen normalisert, og like mengder av lysat affinitets renset på anti-GFP agarose. Like mengder av eluat ble deretter kombinert og underkastet LC-MS/MS analyse. Resultatene av denne analysen blir deretter behandlet for å identifisere høy tillit protein: protein interaksjoner (fig. 1).SILAC immunoprecipitation muliggjør identifisering av ikke bare direkte interaksjon, men også lav affinitet eller indirekte interaksjoner med protein komplekser fire. Ved hjelp av dette system, eIF4AI og II immunoutfellinger tillates reproduserbar og trygg identifisering av den primære bindingspartner eIF4G (isoformer I / II og III) 5, så vel som indirekte interaksjon med eIF4E, og en rekke komponenter av eIF3 kompleks.
Den SILAC pulldown strategi beskrevet her representerer en svært sensitive og kraftige måten å påvise roman protein: protein interaksjoner, og dessuten gjør den rask og enkel diskriminering av endrede bindende mønstre mellom nært beslektede prøver av interesse. I dette eksempelet denne teknikken ble brukt til å undersøke protein: protein interaksjoner av eIF4AI og eIF4AII proteiner seks. Til forfatterens kunnskap, er dette den første studien i litteraturen utnytte nytten av SILAC proteomikk å undersøke mobil interactome av disse to isoformer av eIF4A.
Fremgangsmåten som er beskrevet ovenfor benytter en GFP-tag-og anti-GFP perler 9, 10 og derfor kan det være nødvendig modifikasjon for å muliggjøre denne tilnærmingen kan brukes for en bestemt protein av interesse, for eksempel hvorvidt koden er plassert i N-eller C-terminus av et protein. Der det er mulig, vestlige blotter eller funksjonelle analyser børbli utført for å påvise binding av et kjent protein interaksjon partner. Skulle et protein ikke tolerere fusjon med en GFP tag, andre tagging eller pulldown strategier har blitt brukt til SILAC nedtrekk ved hjelp av både andre koder (flagg 11, Biotin 12, STREP (egne data, upublisert)), eller ved å bruke primære antistoffer mot et protein av interesse der siRNA knockdown av målproteinet gir en kontrollprøve 13.. Slike eksperimenter er beskrevet andre steder i litteraturen, men i korte trekk, trinn 1 og trinn 5,4 til 8 vil bli brukt som ovenfor, med trinn 2 til 5,3 modifiserte som riktig for uttrykket / pulldown system av valg med lik protein-innganger som beskrevet i trinn 02.04 til 02.05. Som kvantifisering faser tillate ikke-spesifikke bindingsproteiner som skal fjernes ved analyse nivå, er det anbefalt å utelate pre-inkubering med kontrollperlene eller høye saltvaskinger for å opprettholde lav-affinitets protein: proteininteraksjoner med et protein av interesse . En nuclease may skal inkluderes eller utelates fra denne protokollen i henhold til de nærmere detaljer om et bestemt eksperiment. For eksempel: som de proteinene som brukes i denne fremgangsmåten er RNA heli ble RNase cocktail inkludert i protokollen for å fjerne indirekte interaksjon medieres via RNA (trinn 3.2). I noen tilfeller er det imidlertid kunne ha nytte av å kjøre parallelle eksperimenter med og uten nuklease for å identifisere nukleinsyre uselvstendige interaksjoner.
Innenfor denne protokollen, er det bytting av "medium" og "tunge" prøver i replikere eksperimenter anbefales å kontrollere for variasjon introdusert av forskjeller i SILAC media eller cellevekst. Et alternativ kontroll innebærer sekvensiell bytting av alle tre ('lys', 'middels', og 'tunge') media i replica eksperimenter. Mens denne tilnærmingen er potensielt mer stringent, vil det øke kompleksiteten av analysen, slik som i det minste en gjengivelse, et protein av interesse will fremstilles i 'lys' merkede celler, og derfor er det nødvendig å skille mellom proteiner gående identifisert i at lett prøver (miljømessige forurensninger som keratiner), og de som bare er anriket på at lett prøver når bundet til et protein av interesse.
Mens bruken av kvantifiseringen av data tillater diskriminering av spesifikk-fra ikke-spesifikke interaksjoner ved bruk av en terskel, uunngåelig noen ekte interaksjoner kan kastes. Tilnærmingen ovenfor er en enkel og rask metode for å identifisere protein: protein interaksjoner som lett kan forsøkt av forskere med ingen tidligere erfaring med massespektrometri, eller analyse av store protein: protein interaksjons datasett. For de fleste anvendelser er dette mer enn tilstrekkelig for å identifisere nye proteiner av interesse. Ytterligere modifikasjoner av denne metode til å bidra til å redusere dette tap av data, er beskrevet andre steder i litteraturen og inkluderer bruk av en protein frekvens bibliotek hvor kjent forurensningsproteiner for et bestemt sett av eksperimentelle parametre (cellelinje, perle matrise, bufferforhold) kan utelukkes 10, 14. Imidlertid, avhengig av den spesifikke eksperimentelle parametre kan det være nødvendig å kjøre en rekke kontrollforsøk for å generere en limstreng proteom, og dette kan derfor øke både kostnadene og kompleksiteten av forsøket. Ytterligere informasjon om denne teknikken er tilgjengelig fra www.peptracker.co.uk nettstedet 14.
Det bør også bemerkes at den protokoll som er beskrevet ovenfor innebærer å blande forskjellig merkede prøver ved slutten av immunoutfelling prosessen (betegnet et Blanding etter rensing – MAP SILAC eksperimentet). Dette gjøres som protein: protein interaksjoner oppstår ved en gitt likevekt 15. Det bør bemerkes at andre grupper har kombinert dette MAP SILAC tilnærmingen er beskrevet i denne protokoll med inkubering av prøveneforut for nedtrekk (Rensing etter blanding – PAM SILAC) i forskjellige tidsperioder (20 minutter til 2 timer er blitt brukt i litteraturen) 15, 16. På grunnlag av hvor raskt en proteinandel faller mot 1:1, er det mulig å undersøke kvalitativt bindingsaffinitetene og å definere proteiner som stabile eller dynamiske vekselvirkende proteinene 15.
I sammendraget, SILAC nedtrekk representerer en svært kraftig metode for identifisering proteiner i samspill med et gitt protein av interesse, i en fysiologisk relevant setting. Teknikken kan meget lett tilpasses til en rekke forskjellige rensestrategier, slik at dens anvendelse i en hvilken som helst protein av interesse. Beregning av resultatene vesentlig forenkler identifisering av genuine interaksjoner, og tillater avslapning av strenge bufferbetingelser som brukes for å fjerne ikke-spesifikke bindemidler, og dermed bevarer lav affinitet interaksjoner. Som opptil tre prøver kan sammenlignes i ovennevntestrategi, har teknikken klare styrke i å sammenligne forskjeller i proteinbinding mellom forskjellige protein isoformer, mutante proteiner, eller virkningen av farmakologiske inhibitorer. Som hele gel skiver er analysert i stedet for individuelle band som flekken ved Coomassie, antall proteiner identifisert ved høy tillit er vanligvis høyere enn de som er identifisert i en standard GST / TAP-pulldown, og forskningsforventninger i valg proteiner av interesse er fjernet. Teknikken sammen derfor svært gunstig med andre vanlige teknikker som brukes i identifisering av nye protein-interaksjoner (gjær to-hybrid, GST / Hans eller TAP Pulldowns).
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Wellcome Trust og BBSRC til IG. IG er en Wellcome Senior Fellow.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Dundee Cell Products | LM010 | DMEM lacking Arginine and Lysine. (and containing L-glutamine) |
Dialysed FBS (10kDa cutoff) 500ml | Dundee Cell Products | DS1003 | |
Arginine (R0) 25g | Sigma-Aldrich | A8094 | Resuspend 0.5g in 6ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 84mg/ml stock) |
Arginine (R6) 0.5g | Cambridge Isotope Labs | CLM-2265 | Resuspend 0.5g in 6ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 84mg/ml stock) |
Arginine (R10) 0.5g | Cambridge Isotope Labs | CNLM-539 | Resuspend 0.5g in 6ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 84mg/ml stock) |
Lysine (K0) 25g | Sigma-Aldrich | L8662 | Resuspend 0.5g in 3.5ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 146mg/ml stock) |
Lysine (K4) 0.5g | Cambridge Isotope Labs | DLM-2640 | Resuspend 0.5g in 3.5ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 146mg/ml stock) |
Lysine (K8) 0.5g | Cambridge Isotope Labs | CNLM-291 | Resuspend 0.5g in 3.5ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 146mg/ml stock) |
Penicillin-Streptomycin, Liquid. 100ml | Gibco | 15140-122 | |
Lipofectamine 2000 transfection reagent | Invitrogen | 11668-027 | |
GFP-trap Agarose (500μl resin) | Chromotek | gta-20 | |
5x SDS Sample loading buffer | Fisher Scientific | PN39000 | The use of purchased rather than homemade sample buffer is recommended to minimize keratin contamination. |
Protease inhibitor cocktail set III | Calbiochem | 539134 | |
1.7ml prelubricated tubes | Costar | 3207 | |
BCA protein assay kit (1L) | Pierce | 23225 | |
Tris (Trizma) | Sigma-Aldrich | T1503 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
Rnase cocktail | Ambion | AM2286 | |
NP-40 alternative | Millipore | 492016 |