Snel en nauwkeurig de uitgeademde lucht Ammoniak Meting

Introduction

Ammoniak is een bijproduct van alomtegenwoordige eiwitmetabolisme ^1. Ammoniak meting kan dus helpen clinici beoordelen diverse ziekten en wellness staten ^2. Echter, ammoniak moeilijk nauwkeurig te meten via bloed of adem, omdat het zeer reactief. Hoewel vaak gebruikt, bloed testen hebben talrijke nadelen, waaronder fundamentele zorgen over de nauwkeurigheid ^3. Maar het grote probleem met bloed testen is de realiteit dat ze alleen maar episodisch verzameld. Dit is belangrijk omdat ammoniak fysiologie, net als bloedglucose en vele andere metabole processen zijn soepel en steeds veranderende ^4. Daarentegen adem assays zijn volledig niet-invasieve en snel, zo gemakkelijk mogelijk herhaalde maatregelen. Zo adem ammoniak meting is aantrekkelijk omdat het een ernstige onvervulde behoefte kan richten op een unieke manier.

Adem verzamelen echter weer specifieke problemen. Overwegende aderlaten inherent draagt ​​de jeopardy van fouten in verschillende onvoorspelbare manieren (bijv. tourniquet tijd, zweet besmetting, bloedcel hemolyse, vertraging in het laboratorium meten, etc ^5), moet de meting adem onderzoekers kampen met een andere groep van nieuwe uitdagingen: variabiliteit in de ademhaling, besmetting met het mondslijmvlies of bacteriële ammoniak, invloed van luchtkwaliteit en apparaten vochtigheid en temperatuur, etc ^6. Inderdaad, is het onverstandig om de taak te onderschatten in het verbinden experimentele apparatuur voor de mens met behulp van experimentele procedures om onbekende biologie ontdekken. Mede door deze obstakels, adem ammoniak nog niet zijn potentieel ontmoet.

Hierin presenteren we onze adem ammoniak meetprotocol voor snelle en nauwkeurige resultaten. Ons protocol heeft kracht in drie gebieden: de monitor, de interface sampler, en aandacht voor de menselijke invloeden. De monitor werd gebouwd door collega's van Rice University zoals eerder beschreven ^7. De basis van de measurement is een kwarts verbeterde fotoakoestische spectroscopie (QEPAS) techniek die een piëzo-elektrische kwarts stemvork telt als een akoestische transducer. Fotoakoestische effect treedt op wanneer akoestische golven worden geproduceerd door de absorptie van gemoduleerde laserstralen door doelspoor gas soorten. De trace gas wordt gedetecteerd met een akoestische cel die akoestisch resonant de gemoduleerde frequentie. Een absorptie golflengte voor ammoniak werd geselecteerd die vrij is van spectrale storingen bemoeien soorten in de adem. Voor de toepassing van menselijke uitgeademde meting adem, de belangrijkste kenmerken van de monitor omvatten een breed meetbereik (van ~ 50 delen per miljard, ppb tot minstens 5000 ppb) en snelheid (1 sec metingen). De snelheid van de monitorfunctie kan gedurende de ademhalingscyclus tijdsresolutie.

De monitor is gekoppeld met een speciaal ontworpen adem sampler. De sampler bestaat uit een druksensor en capnograaf. Het toont en archieven real timemetingen van mond druk en kooldioxide en ammoniak concentraties, bepaald door de sensor. Deze sampler Daardoor kunnen de technicus de kwaliteit van de ademhaling inspanning evalueren de adem wordt verzameld. Dit stelt ons in staat om de aanbevelingen voor het analyseren van de adem stikstofmonoxide (Fe _NO) door de Task Force van de American Thoracic Society / European Respiratory Society (ATS / ERS) ⁸ voorgestelde overschrijden. Voor alle adem steekproef, werd een wegwerp one-way in-line ventiel gebruikt op de mond poort van de adem sampler.

Vanwege de snelheid van de monitor en de kwaliteitscontroles door de sampler, waren we in staat om zorgvuldig te evalueren menselijke invloeden ^9. De meeste proefpersonen bijvoorbeeld eerst hyperventilate op commando ademen. Andere belangrijke invloeden, zoals orale pH en mondspoelingen, temperaturen van de sampler, monitor en alle bijbehorende slangen, en de wijze van ademhaling, werden vervolgens bestudeerd, en zijn de basis for de illustratieve experimenten hieronder.

Ten slotte, en misschien wel het belangrijkst, moet worden benadrukt dat meerdere zeer ervaren groepen meet adem ammoniak met behulp van geheel verschillende sensoren en meetprocedures. Deze kunnen belangrijke voordelen en geldig zijn. Een volledige vergelijking valt buiten het bestek van de onderhavige werk ^10,11,12.

Protocol

1. Voorbereiding van instrumenten

1. Schakel de externe stroomtoevoer naar de ammoniak optische sensor platform, laserdiode controller, een custom-built controle-elektronica-eenheid (CEU), de adem sampler, luchtpomp, en laptop.
2. Controleer dat zowel de uitlaat en ventilatoren van de ammoniak sensor werken. OPMERKING: Een daarvan is gelegen aan de achterzijde van de sensor, wordt de tweede gevonden in de sensor, die gemakkelijk toegankelijk is.
3. Zorg ervoor dat de akoestische detectie module en naaldventiel temperatuur zijn dan 38,0 ° C door het controleren van de digitale display aan de zijkant van de doos ammoniak sensor. Wacht ongeveer 35 minuten vanaf het moment dat de sensor wordt geleverd vermogen voor de temperatuur te stabiliseren.
4. Stel inlaat slangen en mondstuk temperatuur tot 55 ° C door te klikken op een pictogram naam "ChangeT" op het bureaublad van de adem sampler. De temperatuur kan dan door te klikken op de pijl omhoog of omlaag, gevolgd door te klikken op "Upd worden veranderdaten Temp ". Klik op "Exit" om terug te keren naar het bureaublad. Laat het systeem tenminste 5 minuten om de temperatuur te stabiliseren. De temperatuur van de sampler en slangen bij 55 ° C minimaliseert het oppervlak verloren ammoniak.
5. Open de software op de laptop die de ammoniak sensor regelt. Het programma kan worden geraadpleegd binnen een map met de naam "NH ₃ Breath Sensor Program" op het bureaublad. Binnen deze map, moet de gebruiker op het pictogram "main LabVIEW software" te selecteren. Deze map bevat verschillende toepassingen, maar de gebruiker moet "Mainsequence.vi" selecteren om toegang te krijgen tot de gewenste interface. Selecteer "run" in de linker bovenhoek van het scherm. OPMERKING: Dit begint de lijn vergrendeling ijkingsequentie. De laser van de QEPAS monitor werkt op een optimale stroom, die wordt geselecteerd tijdens een geautomatiseerde online vergrendeling procedure. Dit proces zal ongeveer 25 minuten duren.
6. Maak een nieuwe sessie op de sampler zodanig dat each onderwerp sessie heeft zijn eigen bestand dat is opgeslagen op een aangesloten flash drive. OPMERKING: Dit wordt uitgevoerd door het openen van het programma "Breath Sampler" op het bureaublad van de sampler. Er is speelt de sessie adequate wijze. Alle gegevens die tijdens de sessie zal worden opgeslagen in de flash drive onder deze 'identifier. De datum van het experiment wordt meestal gebruikt als onderdeel van de bestandsnaam. De inlaat-en mondstuk temperatuur moet worden aangepast voordat de adem-sampling programma.
7. Plaats een nieuwe disposable mondstuk in de inlaat pijp. Draag wegwerphandschoenen te voorkomen dat besmetting van mondstuk met ammoniak uit de vingers.

2. Breath Sample Collection

OPMERKING: De relevante Institutional Review Board (Ethics Board) moet alle onderzoek dat proefpersonen gaat goedkeuren. Er zijn vele factoren die drastisch kan beïnvloeden adem ammoniak. Deze factoren kunnen adem ammoniak metingen te veranderen door direct eenffecting systemische ammoniak niveaus of door het beïnvloeden van de reis van de adem metabolieten van de longen naar de instrumentatie.

1. Zorgen onderwerpen komen naar het lab in een nuchtere toestand, geen eten hebben verbruikt voor ongeveer 12 uur bij aankomst en dat ze de ochtend voorafgaand aan het testen van afgezien oefening.
2. Controleer of er geen stof is geïntroduceerd in de mond voor minstens 1 uur voorafgaand aan het verzamelen van gegevens. Zorg ervoor dat de proefpersonen hun tanden poetsen meer dan 1 uur voor het testen.
3. Seat het onderwerp voor de ammoniak-sensor. Instrueer het onderwerp aan de inlaat pijp te houden, en zorg ervoor dat ze niet het mondstuk aan te raken om ammoniak te voorkomen.
4. Klik op "Start" op de sampler interface. Zijn het onderwerp uitademen in het mondstuk zo lang mogelijk, of totdat de operator acht het monster volstaan. OPMERKING: Dit is een volledige uitademing van ten minste 10 sec. Mond druk wordt gemeten in real time als een surrogaatvoor debiet. Een gekleurde manometer helpt de onderwerp producten en de gewenste uitademing druk van 10 cm water, waarvan een uitademing stroomsnelheid van 50 ml / sec vertegenwoordigt handhaven. Deze stroomsnelheid werd gekozen omdat het door de ATS / ERS is vastgesteld voor het protocol te bepalen Fe _NO. Deze uitademing debiet is haalbaar door kinderen en volwassenen. Ook drie reproduceerbare uitademingen worden verkregen die verschillen met minder dan 10%.
5. Klik op "Stop" op de sampler-interface als de adem monster is voltooid.

3. Ademtest Meting

1. Zodra een ademtest is geanalyseerd, de laborant die de monitor heeft dan de mogelijkheid om elk segment van die adem profiel analyseren. Het gedeelte van de adem die van belang is de fase III segment. Dit wordt gekenmerkt door een "plateau" in de concentratie van kooldioxide en in het midden aan de late fase van de breath.
2. Selecteer de fase III gedeelte van het monster door de verticale lijnen te slepen op de sampler-interface om te beginnen wanneer kooldioxide plateaus en stoppen vlak voor de drukval van de adem. Zie Figuur 1 voor verduidelijking.
3. Sla de data op de stick door te klikken op "Opslaan" op de sampler touch screen interface.
4. Zodra de adem gegevens zijn opgeslagen, kan de gebruiker "start" te selecteren om een ​​nieuwe ademtest initiëren.

4. Ter illustratie van de effecten van de mond spoelen en pH op Breath Ammoniak

1. Proef 3 ademhalingen aan de basislijn ammoniak niveau. Zorg dat adem tenminste 5 minuten van elkaar worden genomen.
2. Mond goed spoelen met 30 ml van water gedurende 60 sec.
3. Verzamel een ademtest binnen 60 seconden van de spoelen (paragraaf 2). Verzamel ademmonsters in de loop van het volgende uur om de verandering in ammoniak in de tijd te observeren. OPMERKING: Samselen kunnen zo vaak worden genomen elke minuut maar langere intervallen worden doorgaans gebruikt.
4. Mond goed spoelen met 30 ml van basische oplossing (natriumbicarbonaat in water) gedurende 60 seconden en herhaal 4.2.1.
5. Mond goed spoelen met 30 ml van zure oplossing gedurende 60 seconden en herhaal 4.2.1.

5. Ter illustratie van de effecten van Inlet en Transport Tubing Temperaturen op Breath Ammoniak

1. Voorbeeld drie ademhalingen in de loop van 15 min met de inlaattemperatuur ingesteld onder de lichaamstemperatuur ongeveer 30 ° C.
2. Verhoog de temperatuur van de inlaat-en transport buizen tot 55 ° C respectievelijk met behulp van een pictogram op het bureaublad op het touch screen interface van de adem sampler. Laat het systeem tenminste 5 minuten tot steady state te bereiken.
3. Sample 3 ademhalingen, 5 min van elkaar in de verwarmde inlaat.

Representative Results

Onderwerpen kunnen worden verwacht om een ​​breed scala van de baseline adem ammoniak niveaus te produceren. Gezonde personen kunnen de dag beginnen met een adem ammoniak meting van 100-1000 ppb. Het spoelen van de mond met elke vloeistof verandert onmiddellijk de hoeveelheid detecteerbaar adem ammoniak. Neutrale en zure vloeistoffen meestal snijd de hoeveelheid waarneembare ammoniak door meer dan de helft. Deze niveaus dan terug naar de uitgangswaarde als de effecten van de spoelen verdwijnt. De effecten van het water lijken te verdwijnen binnen 15 min, terwijl een zuur detecteerbaar adem ammoniak kan tot een minimum voor meer dan 2 uur. Een basis spoeling, zoals natriumbicarbonaat, zal verdubbelen of verdrievoudigen de hoeveelheid detecteerbaar adem ammoniak alvorens terug te keren naar de uitgangswaarde over een 20 min periode. Met name heeft waterstofperoxide niet te uitgeademde lucht ammoniak meer dan andere keren gespoeld beïnvloeden; dus lijkt het niet dat orale bacteriën een belangrijke bijdrage leveren om te ademen ammoniak meting.

Zoals opgemerkt eenbove de sampler gekoppeld met de ammoniaksensor levert continue data een technicus kan gebruiken om de kwaliteit van een ademmonster beoordelen. Mond druk en kooldioxide zijn de twee kenmerken van een uitademing gebruikt om een ​​ademtest te valideren. Monddruk dient als een surrogaat voor de luchtstroom van de longen naar de sampler. De technicus moet er zeker van dat een onderwerp is het verstrekken van genoeg stroom van alveolaire lucht, die de metaboliet van belang bevat, in de monitor. Technici moeten een normale mond drukbereik van 9-10,5 cm water verwachten. De uitademing moet heel stabiel zijn in de loop van 10-20 sec, die zich in de standaardafwijking van mond druk manifesteert. Een standaarddeviatie van een kwaliteit adem moet kleiner dan 1 cm water.

Kooldioxide meting is ook belangrijk omdat het in staat stelt beter evaluatie van proces uitademing. Tijdens fase I wordt uitademing geïnitieerd en de samenstelling van uitgeademde gas uit predominant anatomische dode ruimte lucht (~ 21% zuurstof, 0,03% koolstofdioxide, 78% stikstof en 0,5% water), dwz., de lucht die werd ingeademd tijdens de inademing fase van het vorige adem cyclus. Tijdens fase II alveolaire gas overgaat in de anatomische dode ruimte en mengt met een resterende dode ruimte lucht zodat de concentratie van kooldioxide snel toe. De concentratie van kooldioxide in de uitgeademde lucht blijft stijgen, hoewel minder snel tijdens fase III uitademing en de piekwaarde (einde tidal concentratie) overeenkomt met de concentratie van kooldioxide in veneus bloed. Deze geleidelijke stijging kooldioxideconcentratie in fase III door mengen van de alveolaire gassen met de rest van de dode ruimte lucht en door legen longblaasjes vertragen. De samenstelling van de adem eind van fase III bedraagt ​​ongeveer 13% zuurstof, 5% koolstofdioxide, 78% stikstof en 4% water. Niveaus van kooldioxide in de fase III-deel van de breath kan variëren van 30-40 mmHg. Fase III komt overeen met waar deze CO ₂ verdiepingen plateau (figuren 1A-D).

Figuur 1. Ademmonsters dat de fase III deel van adem gegevens te integreren voor verschillende aandoeningen. 1a) Een typische ademtest dat de fase III gedeelte van de adem data integreert. De groene en rode verticale lijnen stellen de overspanning waarin de lijn moet worden geanalyseerd. De eerste gedeelten van de uitademing worden genegeerd. 1b) Het effect van een zure spoeling heeft op adem ammoniak. De omzetting van _NH3 tot _NH4 ⁺ drastisch verlaagt de hoeveelheid detecteerbaar ammoniak. Verminderde stroom resulteert in de vermindering van alveolaire ammoniak in de bemonsterde adem zoals in 1c. De verminderde doorstroming doet not staan ​​zoveel alveolaire lucht te bemonsteren. 1d) Een ademtest die fasen I, II, en III integreert. De opneming van de fasen I en II bij de analyse verlaagt ammoniak en kooldioxide aanzienlijk. Dit is een onjuiste weergave van systemische ammoniak. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

De meeste onderwerpen zijn in staat om een ​​aanvaardbare adem te produceren op hun eerste poging. Echter, sommige patiënten een herhaling van de ademhaling vereist. Verder, als de druk en kooldioxide zijn opgenomen, kunnen deze ook worden overwogen gegevensanalyse.

Discussion

De voordelen van een niet-invasieve methode voor het opsporen van sporen metabolieten in real time zijn duidelijk. Echter, op het gebied van adem onderzoek heeft moeite om dit potentieel te vervullen. Adem meting is een dynamisch proces aan velerlei verstorende factoren. Onze aanpak heeft belangrijke troeven: in het bijzonder, hebben de gevoeligheid en snelheid van de Rice QEPAS gebaseerd ammoniak-monitor gekoppeld aan de adem sampler ons in staat om te evalueren en te identificeren adem collectie factoren relevant voor nauwkeurige meting. Deze benadering is zeer betrouwbaar: bijvoorbeeld na enkele voorlopige experimenten, elk bijna 500 afzonderlijke adem gegevenspunten verzameld recente experimenten was consistent met de verwachte resultaten ^9.

Tot de verschillende factoren die uitgeademde lucht ammoniak beter begrepen, is het belangrijk om grondig en uniform instructies uit te voeren bieden aan patiënten. Op dit moment in het algemeen vragen wij onderwerpen aansnel na middernacht voor 's ochtends verzamelen, poetsen hun tanden groter dan 1 uur voorafgaand aan de presentatie, en lichaamsbeweging, roken of het vullen van auto's met petroleum brandstoffen te voorkomen. Hoewel we geëvalueerd hebben verschillende voedingsmiddelen regimes de avond voor het verzamelen van gegevens (bijvoorbeeld, vezelrijk v. weinig vezels), hebben we niet aangetoond dat dieet overtuigende effecten basisgegevens de ochtend van de test. Ochtend collecties ook het effect van de schijnbare dagelijkse variaties, die lijken te komen om onbekende redenen ¹³ minimaliseren.

Er kunnen andere, even geldig is of methoden voor superieure uitgeademde lucht ammoniak collectie. Het is bijvoorbeeld mogelijk dat een standaard spoelen op een vast tijdstip voorafgaand aan adem collectie zou kunnen resulteren in de bruikbare meting van mondslijmvlies ammoniak die ook zouden kunnen doen systemische niveaus. Een andere weg zou kunnen zijn om de mondholte te verlaten en te meten nasale ammoniak of beide ^10,14. Deze laatste benadering zou de noodzaak ondervangen for de interface sampler. Ongeacht, moet elke werkwijze zorgvuldig overwegen verschillende technische factoren deze vluchtige metaboliet zoals vochtigheid, temperatuur, pH, stroom, evenals orofaryngeale biologie relevant.

Natuurlijk, aannames en overtuigingen over meetmethode hebben sterke weerslag op data-analyse. Wij geloven dat de druk en kooldioxide belangrijk aspect van kwaliteitscontrole. Het is echter niet zeker, bijvoorbeeld of ammoniak moet worden opgegeven als gemeten, of kooldioxide-aangepast, met eenheden als ppb of picomol. Naarmate er meer ervaring en vertrouwen zijn opgedaan in de diverse technische bronnen van fouten, de complexe overwegingen incumbent in data-analyse komen in meer focus en zal een beter begrip van deze zeer uitdagende biologie stuwen. (Figuur 2: Random en Non-Random Error Meten True Biologische variabiliteit Versus Een Biologisch bijverschijnselen of B Abnormale Breathing...en orale / nasale Factors of C en D. Prestaties van de apparatuur.)

Figuur 2. Schema van de patiënt om te ademen interface voor een ammoniak-monitor. A) patiënt te testen en is ook de meest onvoorspelbare deel van de ademhaling inzamelingsproces. Patiënten 'eten, lichaamsbeweging en rookgewoonten kunnen grote gevolgen hebben voor het verzamelen van gegevens hebben. B) Breath uitwasemingen zijn variabel van persoon tot persoon, dus een methode om adem te standaardiseren is belangrijk. Het verstrekken van een visuele aanwijzing om gewenste luchtstroom van de longen voor werken goed op uitademingen uniform houden. C) Breath interfaceapparatuur is nauw verwant aan B, dat adem consistentie een belangrijke factor bij het ​​vergelijken onderwerpen. De adem sampler intece kan de gebruiker verschillende ademtest parameters in real-time te bekijken. D) Ammoniak monitoren kan zich manifesteren met verschillende technologieën. Quartz verbeterde fotoakoestische spectroscopie heeft vele inherente voordelen geloofden ideaal voor ademanalyse te zijn. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Belangrijke beperkingen aan de huidige werkwijze moet worden erkend. Terwijl de sampler relatief goedkoop en draagbaar, ammoniak beeldscherm, zoals thans geconfigureerd noch. Bijgevolg moet onderwerpen gewijd ons adem onderzoekruimte komen, wij kunnen geen beweging onze apparatuur naar de kliniek. Deze factor, samen met de eis dat de adem onderwerp uitademen een lange adem, effecten die onderwerpen kunnen worden bestudeerd (dwz zieke patiënten met levercirrose, een belangrijke doelgroep, zijn vaak praktijktisch uitgesloten). Verder, want we hebben slechts een monitor, zijn we beperkt in het aantal onderwerpen die realistisch kan worden bestudeerd in een bepaald protocol. Op zijn beurt, dit van invloed steekproefgrootte en macht.

Zoals hierboven vermeld, werd de collectie van stikstofmonoxide gestandaardiseerd door de gezamenlijke inspanning van de American Thoracic Society en de European Respiratory Society. Er is momenteel geen equivalent overeenkomst naar adem ammoniak, hoewel meerdere groepen maken kritische bijdragen aan de vooruitgang van de adem ammoniak meting. Omdat de literatuur over trace adem metaboliet meting in het algemeen en ammoniak in het bijzonder blijft evolueren ¹⁵ er zal zeker vele wijzigingen en verbeteringen te komen. Monitoren die kleiner, meer draagbare en goedkoper zijn essentieel voor een succesvolle multicenter klinische proeven.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rice Ammonia Monitor System	N/A	N/A	Not available for commercial purchase
Loccioni Breath Sampler	Loccioni Humancare	N/A	Single breath version
Disposable Mouth Piece	WestPrime Healthcare	G011-200	Manufacturer is AlcoQuant
Laptop	Lenovo	N/A	Old model no longer sold by manufacturer
Acid Rinse	N/A	N/A	Household acidic drink (coffee, soft drink, citrus juices, etc)
Base Rinse	N/A	N/A	Water mixed with a nonexact amount of sodium bicarbonate (Arm & Hammer Baking Soda)
Neutral Rinse	N/A	N/A	Water