Rapide et précis expiré Breath ammoniac mesure

Introduction

L'ammoniac est un sous-produit ubiquitaire du métabolisme des protéines ^1. mesure de l'ammoniac peut donc aider les cliniciens à évaluer diverses maladies et états de bien-être ^2. Cependant, l'ammoniac est difficile à mesurer avec précision, par le sang ou d'haleine, car il est très réactif. Bien que couramment utilisé, les tests sanguins présentent de nombreux inconvénients, y compris les préoccupations de base sur la précision ^3. Mais le problème majeur avec les tests sanguins est la réalité que ne jamais ils ont recueilli de façon épisodique. Ceci est important parce que la physiologie de l'ammoniac, un peu comme le glucose dans le sang et de nombreux autres processus métaboliques, sont fluides et en constante évolution ^4. En revanche, les tests d'haleine sont entièrement non-invasive et rapide, ce qui permet facilement de mesures répétées. Ainsi, la mesure de l'ammoniac de souffle est intéressante, car elle peut répondre à un besoin non satisfait grave d'une manière unique.

collection Breath, présente toutefois des préoccupations particulières. Considérant que la saignée porte intrinsèquement le jeopardy d'erreur de plusieurs manières imprévisibles (par exemple, le temps garrot, la contamination de la sueur, l'hémolyse des globules, retard dans la mesure de laboratoire, etc ^5), les chercheurs de mesure du souffle doit composer avec un groupe différent, de nouveaux défis: la variabilité dans la respiration, la contamination par la muqueuse buccale ou de l'ammoniac bactérienne, l'influence de l'air ambiant et un appareil humidité et de température, etc ^6. En effet, il est imprudent de sous-estimer la tâche dans la connexion de matériel expérimental pour les humains en utilisant des procédures expérimentales pour découvrir la biologie inconnu. En partie en raison de ces obstacles, le souffle de l'ammoniac n'a pas encore atteint son potentiel.

Ici, nous vous présentons notre protocole de mesure de l'ammoniac de souffle pour des résultats rapides et précis. Notre protocole a la force dans trois domaines: le moniteur, l'échantillonneur de l'interface, et l'attention sur les influences humaines. Le moniteur a été construit par des collègues de l'Université Rice, comme décrit précédemment ^7. La base de la measurement une amélioration de la spectroscopie photoacoustique de quartz (QEPAS) technique qui emploie un piézoélectrique diapason de quartz comme un transducteur acoustique. Effet photo-acoustique se produit lorsque les ondes acoustiques sont produites par l'absorption du rayonnement laser modulé par des espèces de gaz en traces cibles. Le gaz marqueur est détecté en utilisant une cellule acoustique qui est acoustiquement résonnante à la fréquence modulée. Une longueur d'onde d'absorption de l'ammoniac a été choisi qui est libre d'interférences spectrales d'interférer espèces en haleine. Aux fins de la mesure de l'air expiré humaine, les principales caractéristiques du moniteur comprennent une large gamme de mesure (de ~ 50 parties par milliard, ppb à au moins 5000 ppb) et la vitesse (1 mesures sec). La vitesse de l'écran permet à résolution dans le temps tout au long du cycle de respiration.

Le moniteur est couplé à un échantillonneur de souffle spécialement conçu. L'échantillonneur se compose d'un capteur de pression et capnographe. Il affiche et Archives temps réeldes mesures de pression de la bouche et du dioxyde de carbone, ainsi que les concentrations d'ammoniac déterminées par le capteur. Cet échantillonneur, par conséquent, permet au technicien d'évaluer la qualité de l'effort de souffle que le souffle est recueilli. Cela nous permet de dépasser les recommandations pour l'analyse souffle de l'oxyde nitrique _(NO Fe) proposé par le Groupe de travail de l'American Thoracic Society / European Respiratory Society (ATS / ERS) ^8. Pour tous les échantillons d'haleine, une vanne à une voie disponible en ligne a été utilisé sur l'orifice d'embouchure de l'échantillonneur d'haleine.

En raison de la vitesse de l'écran et les contrôles de qualité fourni par l'échantillonneur, nous avons pu évaluer soigneusement les influences humaines ^9. La plupart des sujets, par exemple, l'hyperventilation initialement sur instructions de respirer. D'autres influences importantes, telles que pH buccal et bains de bouche, les températures de l'échantillonneur, moniteur et tous les tubes associés, et le mode de respiration, ont ensuite été étudiés, et sont à la base for les expériences illustration ci-dessous.

Enfin, et peut-être plus important encore, il faut souligner que plusieurs groupes très expérimentés mesurent souffle ammoniac entièrement à l'aide de différents capteurs et méthodes de mesure. Ceux-ci peuvent avoir des avantages importants et validité. Une comparaison est complète au-delà de la portée de la présente ^10,11,12 de travail.

Protocol

1. Préparation des instruments

1. Allumez l'alimentation externe à la plate-forme de capteur optique de l'ammoniac, contrôleur de diode laser, une unité électronique de commande sur mesure (CEU), l'échantillonneur de souffle, pompe à air, et un ordinateur portable.
2. Vérifier que les deux gaz d'échappement et un ventilateur de refroidissement du capteur d'ammoniac sont en fonctionnement. NOTE: L'une est située à l'arrière de la sonde, le second se trouve à l'intérieur du capteur, qui est facilement accessible.
3. S'assurer que le module de détection acoustique et la température aiguille de soupape sont à 38,0 ° C en contrôlant l'affichage digital situé sur le côté de la boîte de capteur d'ammoniac. Attendez environ 35 minutes à partir du moment que le capteur est fourni pour pouvoir la température se stabilise.
4. Réglez la tubulure d'entrée et la température de l'embout à 55 ° C en cliquant sur le nom de l'icône "ChangeT" trouvé sur le bureau de l'échantillonneur de souffle. La température peut alors être changée en cliquant sur la flèche vers le haut ou vers le bas puis en cliquant sur "Updmangé Temp ". Cliquez sur "Exit" pour revenir au bureau. Permettre au système d'au moins 5 min à la température de se stabiliser. Le maintien de la température de l'échantillonneur et les tubes à 55 ° C minimise la perte d'ammoniac de surface.
5. Ouvrir le logiciel sur l'ordinateur qui commande le capteur d'ammoniac. Le programme peut être consulté dans un dossier nommé "NH ₃ Breath Programme capteur" sur le bureau. Dans ce dossier, l'utilisateur doit sélectionner l'icône "logiciel LabVIEW principale". Ce dossier contient plusieurs applications, mais l'utilisateur doit sélectionner "Mainsequence.vi" pour accéder à l'interface souhaitée. Sélectionnez «run» dans le coin supérieur gauche de l'écran. NOTE: Cela commence la ligne de verrouillage séquence d'étalonnage. Le laser de l'écran QEPAS fonctionne sur un courant optimal, qui est choisi au cours d'une procédure de verrouillage de ligne automatisée. Ce processus prendra environ 25 minutes.
6. Créer une nouvelle session sur l'échantillonneur tels que eaobjet session ch dispose de son propre fichier enregistré sur un lecteur flash ci-joint. NOTE: Ceci est réalisé par l'ouverture du programme "Breath Sampler" trouvé sur le bureau de l'échantillonneur. Il ya un espace pour identifier la session appropriée. Toutes les données obtenues au cours de la session seront enregistrés dans le lecteur flash sous cet identifiant. Le jour de l'expérience, est généralement utilisé comme une partie du nom de fichier. L'entrée et la température de l'embout buccal doivent être réglées avant d'entrer dans le programme souffle-échantillonnage.
7. Insérez un nouveau porte-parole disponible dans le tuyau d'entrée. Porter des gants jetables pour éviter la contamination embout avec de l'ammoniac à partir de doigts.

2. Souffle de prélèvement des échantillons

NOTE: Le comité d'examen institutionnel pertinent (comité d'éthique) doit approuver toute étude sur des sujets humains. Il ya beaucoup de facteurs qui peuvent influencer considérablement le souffle de l'ammoniac. Ces facteurs peuvent modifier les mesures d'ammoniac souffle directement par unffecting niveaux d'ammoniac systémiques ou en affectant le voyage de métabolites de respiration des poumons à l'instrumentation.

1. Assurez sujets arrivent au laboratoire dans un état de jeûne, après avoir consommé aucune nourriture pendant environ 12 heures à l'arrivée et qu'ils se sont abstenus de l'exercice le matin avant le test.
2. Assurez-vous qu'aucune substance a été introduite dans la bouche pendant au moins 1 heure avant la collecte des données. Veiller à ce que les sujets se brossent les dents supérieure à 1 heure avant le test.
3. Seat l'objet devant le capteur d'ammoniac. Demandez au sujet de tenir le tuyau d'entrée, et assurez-vous qu'ils ne touchent pas l'embout buccal pour éviter la contamination de l'ammoniac.
4. Cliquez sur "Démarrer" sur l'interface de l'échantillonneur. Avez-sujet expirer dans l'embout buccal pour aussi longtemps qu'ils le peuvent, ou jusqu'à ce que l'opérateur estime que l'échantillon soit suffisante. NOTE: Il s'agit d'une seule expiration plein durant au moins 10 secondes. pression de la bouche est mesurée en temps réel comme un substitutpour le débit. Un manomètre à code couleur aide le sujet produisent et maintiennent la pression d'expiration souhaitée de 10 cm d'eau, ce qui représente un taux de 50 ml / s de débit expiratoire. Ce débit a été choisi car il a été adopté par l'ATS / ERS pour le protocole pour déterminer Fe _NO. Ce débit expiratoire est réalisable par les enfants et les adultes. De la même façon trois exhalations reproductibles peuvent être obtenus qui diffèrent de moins de 10%.
5. Cliquez sur "Stop" sur l'interface de l'échantillonneur lorsque l'échantillon d'haleine est terminée.

3. Un échantillon d'haleine mesure

1. Une fois un échantillon d'haleine a été analysé, le technicien de laboratoire d'utiliser le moniteur a alors la capacité d'analyser n'importe quel segment de ce profil de souffle. Le passage de la respiration qui est d'intérêt est le segment de phase III. Elle est caractérisée par un "plateau" de la concentration en dioxyde de carbone et se trouve au milieu de stade tardif de la BREath.
2. Sélectionnez la partie III phase de l'échantillon en faisant glisser les lignes verticales sur l'interface de l'échantillonneur de commencer lorsque les plateaux de dioxyde de carbone et d'arrêter juste avant la chute de pression du souffle. Voir la Figure 1 pour des précisions.
3. Enregistrez les données sur le lecteur flash en cliquant sur "Store" sur l'interface de l'écran tactile échantillonneur.
4. Une fois les données d'haleine ont été stockés, l'utilisateur peut sélectionner "Démarrer" pour lancer un nouvel échantillon d'haleine.

4. Illustrant les effets de bain de bouche et du pH sur Breath ammoniac

1. Exemple de 3 respirations pour établir le niveau de base d'ammoniac. S'assurer que les respirations sont prises au moins 5 minutes l'un de l'autre.
2. Rincer soigneusement la bouche avec un 30 ml aliquote de l'eau pendant 60 secondes.
3. Prélever un échantillon d'haleine dans les 60 secondes de rinçage (Section 2). Prélever des échantillons d'haleine au cours de la prochaine heure pour observer le changement dans l'ammoniac au fil du temps. REMARQUE: Samples peut être pris aussi souvent que chaque minute, mais des intervalles plus longs sont généralement utilisés.
4. Rincer soigneusement la bouche avec un 30 ml aliquote de la solution de base (bicarbonate de sodium dans l'eau) pendant 60 secondes et répétez 4.2.1.
5. Rincer soigneusement la bouche avec un 30 ml aliquote de la solution acide pendant 60 secondes et répétez 4.2.1.

5. Illustrant les effets de l'entrée et des transports tubes températures sur Breath ammoniac

1. Exemples trois respirations au cours de 15 min avec la température d'entrée fixés au-dessous de la température du corps, d'environ 30 ° C.
2. Augmenter la température des tubulures d'entrée et de transport à 55 ° C respectivement en utilisant une icône du bureau sur l'interface de l'écran tactile de l'échantillonneur de souffle. Laisser le système au moins 5 minutes pour atteindre l'état d'équilibre.
3. Échantillon 3 respirations, 5 min à part dans l'entrée chauffée.

Representative Results

Les sujets peuvent être tenus de produire un large éventail de niveaux d'ammoniac à couper le souffle de base. Personnes en bonne santé peuvent commencer la journée avec une mesure de l'ammoniac de souffle de 100-1,000 ppb. Rincer la bouche avec tout fluide change immédiatement le montant de l'ammoniac décelable souffle. Généralement fluides neutres et acides couper la quantité d'ammoniac observable par plus de la moitié. Ces niveaux retournent ensuite à la ligne de base que les effets de l'eau de rinçage se dissipe. Les effets de l'eau semblent se dissiper dans les 15 minutes, tandis qu'un acide peut garder détectable souffle ammoniac au minimum plus de 2 heures. Un rinçage de base, comme le bicarbonate de sodium, va doubler ou tripler le montant de l'ammoniac décelable souffle avant de revenir à la ligne de base sur une période de 20 min. Notamment, le peroxyde d'hydrogène ne semble pas affecter expiré souffle ammoniac plus que d'autres rinçages; donc, il ne semble pas que les bactéries orales contribuent de manière significative à la mesure de l'ammoniac de souffle.

Comme notéBove, l'échantillonneur couplé au capteur d'ammoniac fournit des données continues un technicien peut utiliser pour évaluer la qualité d'un échantillon d'haleine. pression de la bouche et du dioxyde de carbone sont les deux caractéristiques d'une exhalation utilisé pour valider un échantillon d'haleine. Bouche de pression sert de substitut à l'écoulement d'air provenant des poumons dans l'échantillonneur. Le technicien doit s'assurer que le sujet fournit suffisamment de flux d'air alvéolaire, qui contient le métabolite d'intérêt, dans le moniteur. Les techniciens doivent s'attendre à une fourchette de 9 à 10,5 cm d'eau à la pression de la bouche normale. L'expiration doit être assez stable au cours des 10 à 20 sec, ce qui se traduit par l'écart type de la pression de bouche. Un écart-type d'un souffle de la qualité doit être de moins de 1 cm d'eau.

la mesure du dioxyde de carbone est également importante, car elle permet une évaluation plus approfondie de processus de l'exhalation. Au cours de la phase I, l'exhalation est initiée et la composition du gaz expiré consiste en prédominante anatomique de l'espace mort aérien (~ 21% d'oxygène, 0,03% de dioxyde de carbone, 78% d'azote et 0,5% d'eau), c.-à-., l'air qui a été insufflé dans le cours de la phase d'inspiration du cycle de respiration précédent. Pendant la phase II, le gaz alvéolaire passe dans l'espace mort anatomique et se mélange avec l'air résiduel de l'espace mort, de sorte que la concentration de dioxyde de carbone augmente rapidement. La concentration de dioxyde de carbone dans l'air expiré ne cesse d'augmenter, bien que plus lentement, pendant l'expiration de la phase III et la valeur de crête (fin de concentration de marée) correspond à la concentration de dioxyde de carbone dans le sang veineux. Cette augmentation graduelle de la concentration de dioxyde de carbone au cours de la Phase III est due au mélange des gaz alvéolaires avec le reste de l'air et de l'espace mort est due à ralentir la vidange de sacs alvéolaires. La composition de la respiration, à la fin de la phase III est d'environ 13% d'oxygène, 5% de dioxyde de carbone, 78% d'azote et 4% d'eau. les niveaux de dioxyde de carbone au cours de la partie III de la phase de la breath peut aller de 30-40 mmHg. Phase III correspond à l'endroit où ces niveaux _de CO ₂ atteignent un plateau (Figures 1A-D).

Figure 1. Échantillons d'haleine qui intègrent la III partie de phase de données d'haleine pour différentes conditions. 1a) Un échantillon d'haleine typique qui intègre la partie III de la phase des données d'haleine. Les lignes verticales vertes et rouges fixés l'intervalle dans lequel la ligne est à analyser. Les premières parties de l'exhalation sont ignorés. 1b) L'effet d'un rinçage acide présente sur le souffle de l'ammoniac. La conversion de NH ₃ NH ₄ ⁺ diminue de façon drastique la quantité d'ammoniac détectable. Diminution des résultats d'écoulement dans la réduction de l'ammoniac dans le souffle alvéolaire échantillonné comme on le voit dans 1c. Le débit diminué fait npermettre ot autant d'air alvéolaire à échantillonner. 1d) Un échantillon d'haleine qui intègre des phases I, II, et III. L'inclusion de phases I et II dans l'analyse abaisse l'ammoniac et du dioxyde de carbone considérablement. Il s'agit d'une interprétation inexacte de l'ammoniac systémique. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

La plupart des sujets sont capables de produire un souffle acceptable sur leur premier essai. Cependant, certains sujets nécessiteront une répétition de la respiration. De plus, comme la pression et le dioxyde de carbone sont enregistrés, ceux-ci peuvent également être considérés dans l'analyse des données.

Discussion

Les avantages d'une procédure non invasive capable de détecter les métabolites de trace en temps réel sont évidents. Cependant, le domaine de la recherche de souffle a du mal à réaliser ce potentiel. mesure de la respiration est un processus dynamique vulnérables à de nombreux facteurs de confusion. Notre approche a des atouts importants: en particulier, la sensibilité et la vitesse du riz QEPAS ammoniac basé sur le moniteur couplé à l'échantillonneur de souffle nous ont permis d'évaluer et d'identifier les facteurs de collecte de souffle germane à une mesure précise. Cette approche est très fiable: par exemple, après quelques expériences préliminaires, chacun des près de 500 points de données d'haleine individuelles collectées pour des expériences récentes était compatible avec le résultat escompté ^9.

Jusqu'à ce que les différents facteurs affectant expiré souffle ammoniac sont mieux compris, il est important de fournir des instructions complètes et uniformes à des sujets avant la date d'arrivée. À l'heure actuelle, nous demandons généralement sujets àrapide après minuit pour la collecte du matin, se brosser les dents supérieure à 1 heure avant la présentation, et éviter l'exercice, le tabagisme, ou de remplir les voitures avec des carburants pétroliers. Bien que nous avons évalué divers aliments schémas de la soirée avant la collecte des données (par exemple, riche en fibres v faible teneur en fibres), nous n'avons pas établi que l'alimentation des données de façon convaincante les effets de base le matin de l'épreuve. collections du matin minimisent également l'impact des variations diurnes apparentes, qui semblent se produire pour des raisons inconnues ^13.

Il peut y avoir d'autres méthodes tout aussi valables ou supérieure pour la collecte exhalé d'ammoniac de souffle. Il est possible, par exemple, qu'un rinçage standard à un point avant la collecte de l'haleine de temps réglée pourrait entraîner la mesure utile de la muqueuse buccale de l'ammoniac qui peut également tenir compte des niveaux systémiques. Une autre voie pourrait être d'abandonner la cavité buccale et de mesurer l'ammoniac nasale ou les deux ^10,14. Cette dernière approche pourrait éviter la nécessité for l'échantillonneur d'interface. Quoiqu'il en soit, toute méthode doit examiner attentivement une variété de facteurs techniques dans ce métabolite volatil y compris l'humidité, la température, le pH, débit, ainsi que la biologie oropharyngée.

Naturellement, les hypothèses et les croyances au sujet de la méthode de mesure ont une incidence critique sur l'analyse des données. Nous pensons que la pression et le dioxyde de carbone sont des aspects clés de contrôle de la qualité. Cependant, il n'est pas certain, par exemple, si l'ammoniac doit être signalé comme mesurée, ou dioxyde de carbone ajusté, avec des unités comme ppb ou pmol. En plus d'expérience et de confiance sont obtenus dans les différentes sources d'erreur technique, les considérations complexes historiques dans l'analyse de données entrent en plus grande attention et seront propulser une meilleure compréhension de la biologie de cette très difficile. (Figure 2: erreur aléatoire et non aléatoire de mesure variabilité réelle biologique par rapport à un épiphénomène ou B biologique respiration anormale...Facteurs et orales / nasales ou C et D. Performance de l'équipement.)

Figure 2. Diagramme de patient à l'interface de respiration à un moniteur d'ammoniac. A) des patients à tester et est également la partie la plus imprévisible du processus de collecte de l'haleine. L'alimentation des patients, l'exercice et le tabagisme peuvent avoir des répercussions importantes sur la collecte de données. B) exhalaisons de souffle sont variables d'une personne à personne, donc une méthode pour normaliser respirations est important. Fournir un repère visuel pour fournir un débit souhaitable de l'air des poumons fonctionne bien pour garder exhalaisons uniforme. C) Dispositif d'interface Breath est étroitement liée à B dans ce souffle cohérence est un facteur important dans la comparaison des sujets. L'échantillonneur intégration de soufflerface permet à l'utilisateur de visualiser différents paramètres de l'échantillon d'haleine en temps réel. D) moniteurs d'ammoniac peuvent se manifester de différentes technologies. spectroscopie photoacoustique amélioré de Quartz a de nombreux avantages inhérents censées être idéal pour l'analyse de l'haleine. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Limites importantes à la présente méthode doivent être reconnus. Alors que l'échantillonneur est relativement peu coûteux et portable, l'écran de l'ammoniac, dans sa configuration actuelle, n'est ni. En conséquence, les sujets doivent venir à notre espace de recherche dédié souffle, comme nous ne pouvons pas facilement déplacer notre matériel à la clinique. Ce facteur, avec l'exigence que le souffle de l'objet expirer une seule longue haleine, les impacts qui peuvent être sujets étudiés (c'est à dire les malades atteints de cirrhose du foie, une population cible, sont souvent pratiquestiquement exclus). En outre, parce que nous avons un seul moniteur, nous sommes limités dans le nombre de sujets qui peuvent être étudiées de manière réaliste dans un protocole donné. À son tour, ce qui affecte la taille de l'échantillon et de la puissance.

Comme indiqué plus haut, la collecte de l'oxyde nitrique a été normalisé par l'effort conjoint de l'American Thoracic Society et l'European Respiratory Society. Il n'existe actuellement aucun accord équivalent pour le souffle de l'ammoniac, bien que plusieurs groupes apportent des contributions essentielles à l'avancement de la mesure de l'ammoniac de souffle. Comme la littérature sur la trace souffle mesure de métabolite en général et de l'ammoniac en particulier continue d'évoluer ¹⁵ il y aura certainement de nombreuses modifications et améliorations à venir. Moniteurs qui sont plus petits, plus mobiles et moins coûteux sont essentielles pour les essais cliniques multicentriques succès.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rice Ammonia Monitor System	N/A	N/A	Not available for commercial purchase
Loccioni Breath Sampler	Loccioni Humancare	N/A	Single breath version
Disposable Mouth Piece	WestPrime Healthcare	G011-200	Manufacturer is AlcoQuant
Laptop	Lenovo	N/A	Old model no longer sold by manufacturer
Acid Rinse	N/A	N/A	Household acidic drink (coffee, soft drink, citrus juices, etc)
Base Rinse	N/A	N/A	Water mixed with a nonexact amount of sodium bicarbonate (Arm & Hammer Baking Soda)
Neutral Rinse	N/A	N/A	Water