פרוטוקול זה מתאר הליך לדגימה סדרתית של מח עצם הירך (BM) מבלי לדרוש הקרבה של עכברים. הליך זה מקל על מחקרי אורך של הרכב ה-BM של עכברים לאורך זמן ומספק גישה סדרתית לתאים בתוך ה-BM למחקרי ex vivo והשתלות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
דגימה סדרתית של ההרכב התאי של מח העצם (BM) היא הליך שגרתי קריטי להמטולוגיה קלינית. פרוטוקול זה מתאר נוהל טכני מפורט שלב אחר שלב להליך אנלוגי בעכברים חיים המאפשר אפיון סדרתי של תאים הקיימים ב-BM. הליך זה מקל על מחקרים שמטרתם לזהות נוכחות של תאים הניתנים באופן אקסוגני בתוך ה-BM של עכברים, כפי שנעשה במחקרי קסנוגרפט למשל. יתר על כן, הליך זה מאפשר שליפה ואפיון של תאים מועשרים ב-BM כגון תאי גזע ואב המטופויאטיים (HSPCs) ללא הקרבה של עכברים. בהתחשב בכך שההרכב התאי של הדם ההיקפי אינו משקף בהכרח את הפרופורציות והסוגים של תאי גזע ואב הנמצאים במח, הליכים המספקים גישה לתא זה מבלי לדרוש הפסקת עכברים מועילים מאוד. השימוש בשאיבת מח עצם עצם הירך מודגם כאן לניתוח ציטולוגי של תאי מח עצם, אפיון ציטומטרי זרימה של תא הגזע / האב ההמטופויאטי ותרבית של HSPCs ממוינים המתקבלים על ידי שאיבת BM עצם הירך בהשוואה לקציר מח עצם קונבנציונלי.
מבוא
כל תאי הדם נגזרים מתאי גזע המטופויאטיים (HSCs). נהלים המאפשרים גישה למח העצם (BM), האתר של הרוב המכריע של HSC בעכברים ובני אדם, מבלי לדרוש הקרבה של בעלי חיים, מספקים משאב לניטור מקור ההמטופואיזיס באופן סדרתי. המטרה הכוללת של ההליך המתואר כאן היא לספק פרוטוקול מפורט לדגימת תאי BM מעצם הירך של עכברים חיים, המספק חומר המייצג את התאים אשר יוחזרו על ידי קציר קונבנציונאלי של תאי BM באמצעות הקרבת העכברים. היתרון של הליך זה על פני קציר קונבנציונאלי של תאי BM הוא שהליך זה אינו דורש הקרבה של עכברים ולכן מאפשר מחקר אורך של תא מח העצם של עכברים לאורך זמן.
למרות שהליך שאיבת מח עצם זה של עכברים שימש במספר מחקרים ותואר בעבר (ראה Sundberg et al. ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
נהלי כל החיה שתוארו בפרוטוקול זה נערכו בהתאם להנחיות לטיפול והשימוש בחי מעבדה ואושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים ושימוש המוסדית (IACUCs) בשעה ממוריאל סלואן קטרינג במרכז הסרטן.
1. שאיפה של מח העצם (BM) תאים מעצם הירך
- להרדים את העכבר שיעבור שאיבת מוח עצם הירך עם isoflurane (1-4%) מנוהל עם מאדה דיוק. עומק ההרדמה צריך להיות במעקב כל דקות 5-10 לאורך כל ההליך על ידי התבוננות, כי אין שינוי בקצב נשימה הקשורים למניפולציה כירורגית ו / או אוזן, בוהן, וקמצוץ זנב. הרדמה מושרה עם is....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
שאיפת הירך BM של עכבר C57/B6 חי נוצלה להשיג תאים מונונוקלארים BM אחרי קציר BM הקונבנציונלי של אותו העכבר לאחר הקרבה. תאים מונונוקלארים BM מתקבלים על ידי שתי השיטות נותחו לאחר מכן על ידי (1) ניתוח ציטולוגית של תאי BM, (2) קביעת השכיחות היחסית של תאי גזע / אבות היווצרות הדם (HSPCs), ו (3) לשעבר vivo תרבות של HSPCs הממוין. בניסוי, Sca1 השושלת שלילית האחרון + c-KIT + תאים (LSK) מוינו מהתאים חד גרעיניים שהושגו על ידי שאיפה BM כמו גם מקציר BM קונבנציונלי. 150 תאי LSK מתקבלים על.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
שאיפת BM סידורי היא הליך שגרתי קריטי לחקירה קלינית של הפרעות המטולוגיות בבני אדם. היכולת לבצע דגימה סידורי מקבילה של BM בעכברים לאפיון של ההרכב התאי ומרכיבים של BM לאורך כל ניסויים ממושכים היא גם יקר מאוד. הליך זה שימושי לאפיון של HSPC של מבלי להקריב את העכבר, אלא גם לגילוי הנוכחות של סוגים נוספים של תאים בBM במקרים שבם התוכן של הדם ההיקפי לא יכול להיות שיקוף של התאים המתגוררים בBM. שאיפת BM סידורי נעשתה שימוש יעיל מאוד למטרה מאוחר יותר בניטור נוכחותם של תאים אנושיים xenografted ל.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
יש המחברים אין לחשוף.
תודות
O.A.-W. נתמך על ידי פרס החוקר הקליני של NIH K08 (1K08CA160647-01), פרס עמית פוסט-דוקטורט של משרד ההגנה האמריקני בחקר אי ספיקת מח עצם (W81XWH-12-1-0041), תוכנית החוקרים של ג'וזי רוברסטון, ופרס החוקר הקליני של דיימון ראניון בתמיכת קרן אוון.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| PBS | PAA | H15-002 | |
| אלבומין סרום בקר | PAA | K41-001 | |
| ACK מאגר ליזה | תוצרת בית | ב-1 ליטר. התאם את ה-pH 7.2 ~ 7.4 ומסנן סטרילי עם 0.22 μ מסנן ואקום מ '. | |
| 8.3 גרם אמוניום כלוריד | פישר סיינטיפיק | A661-500 | |
| 1 גרם אשלגן ביקרבונט | פישר סיינטיפיק | P184-500 | |
| 200 μ l 0.5 M EDTA pH 8 | Gibco | 15575-038 | |
| RPMI 1640 | PAA | E15-842 | |
| 0.5 מ"ל מזרק טוברקולין 27.5 גרם | Becton Dickinson | 305620 | |
| מסננת תאים סטרילית 70 μ m | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Isoflurane, USP | Attane | NDC: 66794-014-25 | |
| מחט קהה | Stemcell Technologies | 28110 | |
| מחט PrecisionGlide 23 גרם | בקטון דיקינסון | 305193 | |
| 3 מ"ל מזרק Luer-Lok tip | Becton Dickinson | 309657 | |
| צלחת מטופלת בתרבית רקמות, 6 באר | בקטון דיקינסון | 351146 | |
| שפופרות 12 x 75 מ"מ 5 מ"ל | Becton Dickinson | 352054 | FACS מכתים |
| 12 x 75 מ"מ צינורות 5 מ"ל עם מכסה מסננת תאים | Becton Dickinson | 352235 | FACS מכתים |
| NK1.1 APC-Cy7 | Biolegend | 108723 | |
| CD11b APC-Cy7 | Biolegend | 101225 | |
| CD45R (B220) APC-Cy7 | Biolegend | 103223 | |
| CD3 APC-Cy7 | Biolegend | ||
| Ly-6G ו-Ly-6C (Gr-1) APC-CY7 | Biolegend | 108423 | |
| Ter119 APC-CY7 | Biolegend | 116223 | |
| CD19 APC-CY7 | Biolegend | 302217 | |
| CD4 APC-Cy7 | BioLegend | 317417 | |
| CD117 (c-KIT) PE | BioLegend | 105808 | |
| Ly-6A/E (Sca-1) PE-Cy7 | Biolegend | ||
| CD34 APC | Biolegend | 128612 | |
| CD16/32 e450 | eBioscience | 48-0161-82 | |
| DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma-Aldrich | 32670 | |
| MethoCult GF M3434 | STEMCELLTECHNOLOGIES | 3434 | לתרבית מתוצלולוזה |
| קרפרופן | סהר כימי חברה | C11045850 | מנה אחת (5 מ"ג/ק"ג) |
| ציטומטר זרימה, LSRמשחה וטרינרית | Dickinson Dickinson | ||
| (משחת עיניים סטרילית של פטרולאטום) | Dechra-US | 17033-211-38 |
מקורות
- Sundberg, R., Hodgson, R. Aspiration of bone marrow in laboratory animals. Blood. 4, 557-561 (1949).
- Schmitz, M., Bourquin, J. -P., Bornhauser, B. C. Alternative technique for intrafemoral injection and bone marrow sampling in mouse transplant models. Leukemia....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
