Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

التعرف السريع على البكتيريا سالبة الجرام من ثقافة الدم في مرق عن طريق MALDI-TOF الطيف الكتلي

Published: May 28, 2014 doi: 10.3791/51663
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2,3, 1,3
1Centre for Infectious Diseases and Microbiology Laboratory Services, Institute of Clinical Pathology and Medical Research, Westmead Hospital, 2Centre for Research Excellence in Critical Infection, Westmead Millennium Institute, Westmead Hospital, 3Sydney Emerging Infectious Diseases Institute, University of Sydney, Westmead Hospital

Summary

تطبيق مصفوفة بمساعدة الليزر الامتزاز / التأين وقت الرحلة (MALDI-TOF) مطياف الكتلة (MS) مباشرة إلى ثقافة الدم مرق يعجل تحديد البكتيريا. طريقة عرض هو طريقة سريعة وموثوق بها لتحديد البكتيريا سالبة الجرام مباشرة من ثقافة الدم المرق.

Abstract

دورا هاما في مختبر علم الأحياء المجهرية السريرية هو توفير التعرف السريع على البكتيريا المسببة للعدوى مجرى الدم. تحديد التقليدية يتطلب ثقافة فرعية من مرق أشار ثقافة الدم مع تحديد متاحة إلا بعد المستعمرات على أجار الصلبة قد نضجت. MALDI-TOF MS هو، طريقة سريعة يمكن الاعتماد عليها لتحديد غالبية البكتيريا ذات الصلة سريريا عندما يطبق على المستعمرات على وسائل الاعلام الصلبة. تطبيق MALDI-TOF MS مباشرة إلى ثقافة الدم مرق هو نهج جذابة كما أن لديها القدرة على تسريع تحديد الأنواع من البكتيريا وتحسين التدبير العلاجي السريري. ومع ذلك، مشكلة هامة للتغلب هو إزالة ما قبل التحليل بالتدخل راتنجات والبروتينات والهيموغلوبين الواردة في عينات الدم التي الثقافة، إن لم يكن إزالتها، وتتداخل مع MS الأطياف ويمكن أن يؤدي إلى تحديد درجات التمييز غير كافية أو منخفضة. بالإضافة إلى أنه من الضروري التركيز bacterالجيش العراقي لتطوير أطياف نوعية كافية. يصف الطريقة المعروضة تركيز، وتنقية، واستخراج البكتيريا سالبة الجرام السماح للتشخيص المبكر من البكتيريا من مرق أشار ثقافة الدم.

Introduction

المرضى الذين يعانون من عدوى مجرى الدم (BSI) وذلك بسبب البكتيريا لا تزال لدينا عالية وفيات في المستشفى، وتتراوح 6-48٪ 1. تسليم المضادات الحيوية المناسبة المجرب يعزز البقاء على قيد الحياة وفي فرعية من المرضى الذين يعانون من التسمم الحاد، كل تأخير ساعة إلى العلاج المناسب يرتبط بقاء انخفضت 2،3. وفقا لذلك، هدفا رئيسيا من المختبر السريري للكشف بسرعة، وتحديد والتواصل وجود البكتيريا في الثقافات الدم لإبلاغ القرارات السريرية. وقد ثبت أن مختبر الميكروبيولوجيا ديها أكبر تأثير على العلاج المضادة للميكروبات في وقت الإبلاغ وصمة عار غرام 4 ومؤخرا، أظهرت دراسة وصفية ذلك الوقت الامتزاز بمساعدة الليزر مصفوفة / تأين مطياف الكتلة الطيران (TOF MALDI-MS) يقوم مباشرة على المرق ثقافة الدم تؤثر وصف في أكثر من ثلث BSI الناجم عن البكتيريا سالبة الجرام 5.

"jove_content"> وقد أدى التطوير التجاري لMALDI-TOF MS إلى أداة فعالة المختبر لتحديد الكائنات الدقيقة 6،7. والآن راسخة التكنولوجيا وتم دمجها في العديد من المختبرات لتحديد سريعة ودقيقة من الكائنات الدقيقة المعزولة على 6،8 وسائل الاعلام الصلبة. التطبيق المباشر للMALDI-TOF MS لثقافة الدم (BC) مرق التي أشار "ايجابية" للكائنات الدقيقة تناشد كل من الأطباء ومديري المختبرات بسبب القدرة على الحصول على تحديد وقت سابق من الكائنات الحية الدقيقة بتكلفة منخفضة.

وقد المنفعة السريرية من التطبيق المباشر للMALDI-TOF MS لثقافة الدم مرق محدودة بسبب مجموعة واسعة من الحساسيات وحظ بالمقارنة مع الأساليب ثقافة المظهرية قياسية استنادا لتحديد الهوية، مع تقارير عن تحديد ناجحة من البكتيريا سالبة الجرام تتراوح 47-98،9 9-11٪. الاختلاف في حساسية المرجحتتعلق تكوين BC مرق، تركيز البكتيريا الأولية، والتباين في أساليب إعداد العينات فضلا عن مجموعة من الكائنات الحية سلبية الغرام التي واجهتها في دراسة السكان 9. مقارنة مع هذه البروتوكولات الأخرى المنشورة على الطريقة المعروضة هنا يتجنب استخدام الإيثانول، كلوريد الأمونيوم أو إضافية (غير المصفوفة) أسيتونتريل. ونتيجة لبيليه البكتيرية سوف تبقى قابلة للحياة (حتى نقطة استخراج البروتين) السماح لطرق الاختبار المظهري التعرض المحتملة ليتم تطبيقها مباشرة إلى هذه الكائنات في المرق. بالإضافة إلى ذلك، فقد تبين طريقة عرض لتكون رخيصة وموثوقة وسريعة مع تحديد البكتيرية المتوفرة في غضون 25 دقيقة من ثقافة الدم غرام النتائج وصمة عار، مع الحد الأدنى 'على يد' الوقت 12.

هذه طريقة بسيطة بروتوكول تدور تحلل في المنزل باستخدام استخراج حمض الفورميك تطبيقها مباشرة على إيجابية مرق ثقافة الدم لتحديد غرام ب سلبيacteria مع التكنولوجيا MALDI-TOF MS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ثقافة الدم الحساء العلم بأنها "ايجابية"

  1. إزالة زجاجة ثقافة الدم أشار المستمر من مجلس الوزراء رصد الحضانة ووضعه في خزانة السلامة البيولوجية. ملاحظة: يمكن أن تحتوي على زجاجات الكائنات الدقيقة الخطرة وتحتاج الاحتياطات العالمية التي ينبغي اتباعها. نظرا لخطر الهباء المعدية في أخذ العينات، ويجب أن يتم تنفيذ جميع إجراءات أخذ العينات في السلامة الأحيائية الدرجة الثانية مجلس الوزراء تدفق الصفحي.

2. غرام وصمة عار على استعداد

  1. يعد وصمة عار غرام من مرق أشار ثقافة الدم وفقا لبروتوكولات المؤسسية المحلية. ملاحظة: عندما يتم تحديد الكائنات السلبية الغرام على المجهر معالجة مرق ثقافة الدم وفقا للطريقة التالية. عندما يتم تحديد الكائنات موجبة الجرام، يتم تطبيق طريقة بديلة تستهدف تحديد الجزيئية الجينية وعلامات مقاومة للمرق (لم يتم تناولها في هذه المقالة) 13.
ه "> 3. نقل الدم مأشر ثقافة مرق إلى مصل فصل أنبوب

  1. المزيج بلطف زجاجة ثقافة الدم عن طريق قلب 2-3X.
  2. داخل مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية إرفاق حقنة 10 مل لجهاز نقل الدم السلامة.
  3. نعلق جهاز نقل الدم إلى زجاجة ثقافة الدم وسحب 5 مل من مرق في حقنة. نقل BC مرق يستنشق في أنبوب فصل المصل.

4. تركيز ثقافة الدم في مرق

  1. أجهزة الطرد المركزي لفصل أنبوب المصل في 1،250 x ج لمدة 15 دقيقة الذي يزيل كمية كبيرة من خلايا الدم الحمراء.
  2. نضح وتجاهل طاف باستخدام ماصة نقل معقمة والحرص على ترك حوالي 1 مل من معطف الشهباء مباشرة فوق واجهة هلام / السوائل. ملاحظة: تظهر الزجاجات الهوائية فصل واضح للخلايا الدم الحمراء في الجزء السفلي من الأنبوب مع واجهة هلام / السوائل التي تظهر على اللون الأبيض مبهمة. في المقابل، عندماتطبق على التحللي اللاهوائية مرق ثقافة الدم تظهر واجهة هلام / السوائل كلون أحمر عميق بسبب مكونات خلايا الدم الحمراء هي lysed تبقى معلقة في طاف.

5. كرر الطرد المركزي غسل خطوات

  1. المزيج بلطف على 1 مل الأخير من السوائل معطف الشهباء فوق واجهة هلام مع ماصة معقمة ثم نقل وحدة التخزين بالكامل في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. أجهزة الطرد المركزي في أنبوب جديد في 288 x ج لمدة 30 ثانية.
  2. نقل طاف باستخدام البلاستيك القابل للتصرف 1 مل ماصة نقل الى جديد 1.5 مل أنبوب microcentrifuge وتجاهل الأنبوب مع بيليه. ملاحظة: ومن المهم في هذه الخطوة التي يتم الحرص على تجنب نقل بيليه. هذا مهم بشكل خاص للعينة التي يجري تجهيزها من الزجاجة قبل الميلاد اللاهوائية، حيث لا يزال طاف المصطبغة وليس دائما ينظر بيليه بوضوح.

6. تحلل الخلايا المتبقية

  • أجهزة الطرد المركزي في العينة 18407 x ج لمدة 1 دقيقة ثم نضح (وتجاهل) طاف باستخدام ماصة غرامة نقل يميل إلى ترك السائل المتبقي أقل قدر ممكن دون تعطيل بيليه.
  • resuspend الكرية المتبقية في 1 مل من الدناز معقمة وريبونوكلياز المياه مجانا من pipetting صعودا وهبوطا. ملاحظة: ووصف بعض الكتاب على استخدام حلول الكحول بدلا من الماء المعقم لresuspend الكرية مما يجعل البكتيريا غير قادرة على البقاء.
  • أجهزة الطرد المركزي الحل معلق في 18407 x ج لمدة 1 دقيقة.

    • 7. استخراج البروتينات البكتيرية

    1. نضح وتجاهل طاف، مرة أخرى باستخدام الطموح مع ماصة غيض غرامة ضمان أكبر قدر ممكن السائل تتم إزالة.
    2. resuspend وبيليه في 10 ميكرولتر حمض الفورميك (70٪ ت / ت). ملاحظة: حمض الفورميك يمكن أن يؤثر على الجسم إذا تم استنشاقه أو إذا كان يأتي في اتصال مع الجلد. عند إعداد أو التلاعب الحلول هو صecommended أن الموظفين استخدام مجلس الوزراء الدخان بالإضافة إلى معدات الحماية الشخصية.
    3. تخلط جيدا باستخدام ماصة لضمان حل معلق متجانس. استخدام غيض ماصة لتعطيل جسديا بيليه قد يكون من الضروري لضمان التوصل إلى حل أكثر تجانسا.

    8. إعداد MALDI-TOF الهدف بلايت

    1. تطعيم نظيفة لوحة الهدف MALDI-TOF مع 2 ميكرولتر من تعليق على استعداد لكل بقعة المستهدفة. 3 إعداد المواقع المستهدفة لكل عينة على التغلب على المشكلة عرضية من فشل يقرأ.
    2. تسمح لوحة الهدف MALDI-TOF لتجف. ويمكن زيادة معدل التجفيف عن طريق وضع لوحة على حافة غطاء الدخان لتعظيم تدفق الهواء عبر لوحة.
    3. تراكب كل بقعة المجففة مع 1 ميكرولتر من الحل مصفوفة (10 ملغ / مل α-سيانو-4-hydroxycinnamic حمض (HCCA)، و 50٪ أسيتونتريل، وحامض trifluoroacetic 2.5٪). ملاحظة: حل مصفوفة يمكن أن يؤثر على الجسم إذا تم استنشاقه أو إذا كان يأتي إلى حساب المشتركط م مع الجلد. عند إعداد أو التلاعب حلول فمن المستحسن أن يستخدم الموظفون خزانة الدخان بالإضافة إلى معدات الحماية الشخصية.
    4. تسمح لوحة الهدف MALDI-TOF لتجف على حافة الدولاب الدخان كما هو موضح أعلاه. ضمان إعداد متجانسة يملأ كل من البقع الهدف على طبق من ذهب.

    9. MALDI-TOF مكان الهدف اللوحة في مطياف الكتلة

    1. إدراج لوحة الهدف MALDI-TOF في مطياف الكتلة MALDI-TOF. ضمان لوحة يجلس مطاردة مع لوحات بنابض. ملاحظة: لا إدراج لوحة الهدف حتى جميع المواقع المستهدفة هي جافة.
    2. ضمان الختم المطاطي نظيفة من الوبر والغبار والشعر للسماح يمكن أن تنشأ ظروف الفراغ المطلوب.
    3. إغلاق مرحلة MALDI-TOF غطاء ثم اضغط على زر "داخل / خارج" على الجزء الأمامي من الصك. سوف الغطاء الآن قفل والسماح للفراغ من الضروري أن تنشأ.

    10. MALDI-TOF MS Spectra اقتناء

    1. فتح MALDI Biotyping والبرمجيات FlexControl.
    2. ضمن برنامج الطباعة حدد "تصنيف جديد" من القائمة المنسدلة تحت عنوان "ملف". اسم المشروع ثم حدد "الجديدة". حدد "التالي" لاستكمال الإعداد ضمن برنامج الكتابة.
    3. ضمن إطار برنامج مكافحة تحديد الرسم على الشاشة من لوحة الهدف. تسليط الضوء على بقع الهدف MALDI-TOF التي يتم استخدامها عن طريق تحريك الماوس فوق البقع تلقيح أثناء الضغط باستمرار على زر الماوس الأيسر.
    4. استخدم زر الماوس الأيمن فوق أي مكان على المناصب الهدف المحدد ثم حدد "إضافة التحاليل" من القائمة المنسدلة.
    5. إضافة ثقافة الدم التفاصيل التعرف إلى العمود "معرف" لكل من البقع الهدف وانقر على زر "التالي" عند اكتماله.
    6. حدد التجارية "التصنيف" قاعدة بيانات الأطياف وحدد "التالي". ملاحظة: لبوratories قد تستخدم إضافية في المنزل أو قواعد البيانات التجارية لزيادة عدد الأطياف المرجعية.
    7. انقر على زر "الانتهاء" وسوف MALDI-TOF MS يبدأ توليد الأطياف. ملاحظة: كانت إعدادات MALDI-TOF حسب إعدادات تصنيع في (الوضع الخطي إيجابية، تردد 60 هرتز ليزر، و 20 كيلو فولت تسريع الجهد، 16.7 كيلو فولت IS2 الجهد، 170 NSEC تأخير استخراج، و2،000-20،137 م / ض المدى).
    8. إذا فشل هذا البرنامج تحكم MALDI لتوليد قمم، واقتناء دليل الأطياف يمكن أداؤها (طريقة وليس وصفها).

    11. تفسير تحليل آخر من MALDI-TOF MS العشرات

    1. مرة واحدة يتم الحصول على أطياف وتحليل كاملة، حدد زر "+" بجانب تحديد الأنواع على برنامج الكتابة لتوسيع قائمة لتحديد هوية كل هدف.
    2. دراسة أعلى 5 تحديد الهوية، مشيرا إلى إن أعلى 5 متشابهة. المتنافرة أعلى 5 أجناس مع عشرات ≥ 1.7 للهدف نفسهأثار بقعة إمكانية مرق مختلطة. ملاحظة: MALDI-TOF التكنولوجيا لديها حساسية ضعيفة للكشف عن مرق مختلطة. على سبيل المثال، عندما يحتوي مرق الأنواع المختلطة على درجة الثقة العالية يمكن تحديدها لمجرد واحدة من الأنواع المختلطة.
    3. عندما يلاحظ على درجة ≥ 2.0 لأعلى المباراة على بقعة المستهدفة، تقريرا الأنواع.
    4. عندما يتم ≥ أعلى الدرجات في بقعة الهدف 1.7، ولكن <2.0، تقرير جنسا فقط. إذا معايير إضافية من ال 5 تحديد الهوية هي متطابقة، ثم يقدم تقريرا إلى مستوى الأنواع.

    12. إزالة MALDI-TOF الهدف بلايت

    1. عندما تكون جميع الأطياف هي زر "داخل / خارج" على الجهاز MALDI-TOF الصحافة كاملة.
    2. فتح MALDI-TOF وحة الهدف وعاء وإزالة لوحة الهدف MALDI-TOF.
    3. في حالة استخدام لوحة قابلة لإعادة الاستخدام الهدف MALDI-TOF، تنظيف جميع بقع الهدف باستخدام الكحول وتخزين وحة MALDI-TOF في RT مرة واحدة أنها نظيفة وجافة.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    تتم مقارنة ولدت MALDI-TOF MS الأطياف لقاعدة البيانات المرجعية المتكاملة للأطياف. يتم تخصيص نقاط لوغاريتمي على الثقة من المباراة بين عزل واختبار قاعدة البيانات المرجعية يعزل، مع توصية من النتيجة ≥ 1.7 اللازمة لتحديد المستوى المحتمل لأجناس (الشكل 1) و≥ 2.0 لتحديد المحتملة على الأنواع (الشكل 2). تقرير لمستوى الأنواع عندما كانت النتيجة ≥ 1.7 و 5 هويات الأولى يقابله برنامج الكتابة يتسق (الشكل 1) 12. يوضح الشكل 3 نتائج عند تحليل مرق ثقافة الدم الأنواع المختلطة، في هذه الحالة كولاي والسراتية الذابلة. لاحظ أعلى 5 الأطياف المتطابقة هي المتنافرة. وقد ثبت سابقا أن أجناس مختلطة ولن يتم تحديدها بواسطة هذه الطريقة في ما يقرب من 30٪ من المرق مختلطة 12. من المهم أن ندرك أن مع مرق مختلطة فمن الممكن لتقرير ثابت من نوع واحد برصيد ثقة عالية ويلخص الجدول 1 النتائج التي تم نشرها مسبقا من الدراسة للتحقق من هذه الطريقة التي 91.8٪ من المرق monomicrobial تحقيق على درجة MALDI-TOF من> 1.7، مع 100٪ و 97.0٪ التوافق إلى جنس والأنواع، على التوالي 12.

    الشكل 1
    الشكل 1. وMALDI-TOF MS الأطياف الناتجة عن الإشريكية القولونية برصيد وغاريتمي من 1.861. إلى اليمين هو 5 مباريات الأولى التي حددها برنامج الكتابة. نلاحظ أن الأنواع يقال باستمرار كما القولونية. مع النتيجة من 1.861 ومع أعلى 5 مباريات كونها E. القولونية يعتبر تحديد يمكن الاعتماد عليها لمستوى الأنواع 12. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الرقم 2
    الشكل 2. وMALDI-TOF MS الأطياف الناتجة عن الزائفة الزنجارية برصيد وغاريتمي من 2.216. إلى اليمين هو 5 مباريات الأولى التي حددها برنامج الكتابة. نلاحظ أن الأنواع يقال باستمرار كما الزائفة الزنجارية. مع درجة عالية من 2.216 تعتبر موثوقة لتحديد مستوى الأنواع من تحديد الهوية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

    lways "> الرقم 3
    الرقم 3. وMALDI-TOF MS الأطياف الناتجة عن الدم المختلط ثقافة مرق يحتوي كولاي والسراتية الذابلة. إلى اليمين هي 5 مباريات الأولى التي حددها برنامج الكتابة التي تفيد كل من الإشريكية القولونية والسراتية الذابلة في أول 5 الأطياف المتطابقة . يتم تعريف هذا أجناس مختلطة فقط في ما يقرب من ثلث الثقافات المختلطة مرق 12. تحسين الإصدارات من البرمجيات في المستقبل قد تؤدي إلى تحسين الكشف عن الثقافات المختلطة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

    0 "/>
    بيانات الجدول 1. التأكيد مقارنة MALDI-TOF MS القيام بها مباشرة على ثقافة الدم مرق مع تحديد المظهري لاحقة على المستعمرات subcultured. تحديد متطابقة المطلوبة على درجة قياس الطيف الكتلي على ثقافة الدم مرق ≥ 1.7. ويتم تكييف هذا الجدول من منشور السابق 12. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    من المهم عند تطبيق MALDI-TOF MS للثقافة مرق الدم الذي يتم تنفيذ الخطوات آخر الطرد المركزي مع الرعاية الكافية لا في التعديل مكونات فصلها. من المهم بصفة خاصة لإزالة مكونات ثقافة الدم والبروتينات الخلوية الإنسان، بما في ذلك الهيموغلوبين، والتي قد تنتج طفرات التدخل مع أطياف MALDI-TOF.

    على الرغم من أن MS بتصنيع يوصي بتخفيض درجة من ≥ 2.0 للأنواع و≥ 1.7 لتحديد جنس، وأشارت تقارير أخرى انخفاض درجات لوغاريتمي (المدى ≥ 1.4 إلى 1.6 ≥) يمكن تنفيذها عند تطبيقها على BC مرق 10،12،14-18. وينبغي النظر في تنفيذ انخفاض درجات تحديد ماجستير في علم الأحياء المجهرية السريرية المختبرات إلا بعد التحقق من صحة الإجراءات التنظيمية والمحلية المناسبة.

    يتم إنشاؤها أطياف أحيانا الفقراء من خلال هذه الطريقة التي هي إما غير متطابق، أو ترد مع لترآه عشرات الثقة. يمكن أداء ثلاث نسخ مكررة أو البقع لكل عزل تقليل الإزعاج من تكرار التجربة عندما فشل بقعة واحدة. نادرا، فإن جميع البقع مكررة لا يسجل فيه الكفاية لتحديد الهوية. قد تكون سببا في تحديد الفقراء بسبب مجموعات قاعدة البيانات غير مكتملة، أو أكثر شيوعا، نتيجة لتركيز انطلاق منخفضة من البكتيريا في مرق ثقافة الدم. في مجموعة التحقق من صحة تنشر لطريقة عرض بنتيجة <1.7 تمت مصادفة في 8٪ من العزلات السريرية، وكان لها غلبة طفيفة عندما أجريت على اللاهوائية زجاجات ثقافة الدم 12.

    MALDI-TOF التكنولوجيا MS غير قادر على فصل كل اجه سريريا البكتيريا سالبة الجرام حتى عندما عزل على وسائل الاعلام الصلبة. على سبيل المثال، E. لن يتم تمييزها القولونية من الأنواع الشغيلة ولا يمكن speciated أجناس السالمونيلا. كما هو مبين في النتائج فمن المهم أن ندرك عشرفي عند استخدام MALDI-TOF مباشرة على ثقافة الدم مرق حساسية للكشف عن الأنواع المختلطة منخفضة 11،12،18،19.

    عموما، فإن هذا النهج يوفر طريقة سريعة وغير مكلفة، ويمكن الاعتماد عليها لتحديد أكثر من 90٪ من غرام يعزل ثقافة الدم السلبية في غضون 25 دقيقة من الإشارات ثقافة الدم المرق.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    BACTEC Plus Aerobic/F Medium Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA 442192
    BACTEC Lytic/10 Anaerobic/F Medium Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA 442265
    BACTEC Peds Plus Medium Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA 442194
    Vacutainer - Blood transfer device Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA 364880 Single use sampling device reducing the risk of needlestick injury
    Vacutainer SST 5.0 ml, Advance plus Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA 367954 Serum separating tube
    Syringe 10 ml Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA 302143
    Transfer pipette Samco, USA 222-20S
    Transfer pipette (fine tipped) Samco, USA 232-20S
    Microcentrifuge tube (2.0 ml) Eppendorf, Hamburg, Germany 0030.120.094
    Sterile water (DNAse and RNAse free) Life Technologies, Carlsbad, California, USA 10977-015
    Formic acid Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA F0507
    Matrix solution  Bruker Daltonics, Bremen Germany 285074 10 mg/ml α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, 50% acetonitrile, 2.5% trifluoroacetic acid
    Benchtop microflex LT MALDI-TOF MS Bruker Daltonics, Bremen Germany Utilizing BioTyper 3.1 (Build 65) and FlexControl 3.3 (Build 99) software

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Bearman, G. M., Wenzel, R. P. Bacteremias: a leading cause of death. Arch. Med. Res. 36 (6), 646-659 (2005).
    2. Leibovici, L., Shraga, I., Drucker, M., Konigsberger, H., Samra, Z., Pitlik, S. D. The benefit of appropriate empirical antibiotic treatment in patients with bloodstream infection. J. Intern. Med. 244 (5), 379-386 (1998).
    3. Kumar, A., et al. Duration of hypotension before initiation of effective antimicrobial therapy is the critical determinant of survival in human septic shock. Crit. Care Med. 34 (6), 1589-1596 (2006).
    4. Munson, E. L., Diekema, D. J., Beekmann, S. E., Chapin, K. C., Doern, G. V. Detection and treatment of bloodstream infection: laboratory reporting and antimicrobial management. J. Clin. Microbiol. 41 (1), 495-497 (2003).
    5. Clerc, O., Prod'hom, G., Vogne, C., Bizzini, A., Calandra, T., Greub, G. Impact of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry on the Clinical Management of Patients With Gram-negative Bacteremia: A Prospective Observational Study. Clin. Infect. Dis. 56 (8), 1101-1107 (2013).
    6. Dekker, J. P., Branda, J. A. MALDI-TOF Mass Spectrometry in the Clinical Microbiology Laboratory. Clinical Microbiology Newslette. 33 (12), 87-93 (2011).
    7. Seng, P., et al. Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin. Infect. Dis. 49 (4), 543-551 (2009).
    8. Neville, S. A., et al. Utility of matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry following introduction for routine laboratory bacterial identification. J. Clin. Microbiol. 49 (8), 2980-2984 (2011).
    9. Schmidt, V., Jarosch, A., März, P., Sander, C., Vacata, V., Kalka-Moll, W. Rapid identification of bacteria in positive blood culture by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 31 (3), 311-317 (2012).
    10. March-Rosselló, G. A., Muñoz-Moreno, M. F., de Urriés, M. C., Bratos-Pérez, M. A. A differential centrifugation protocol and validation criterion for enhancing mass spectrometry (MALDI-TOF) results in microbial identification using blood culture growth bottles. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 32 (5), 699-704 (2012).
    11. Christner, M., Rohde, H., Wolters, M., Sobottka, I., Wegscheider, K., Aepfelbacher, M. Rapid identification of bacteria from positive blood culture bottles by use of matrix-assisted laser desorption-ionization time of flight mass spectrometry fingerprinting. J. Clin. Microbiol. 48 (5), 1584-1591 (2010).
    12. Gray, T. J., Thomas, L., Olma, T., Iredell, J. R., Chen, S. C. Rapid identification of Gram-negative organisms from blood culture bottles using a modified extraction method and MALDI-TOF mass spectrometry. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 72 (2), 110-112 (2013).
    13. Hazelton, B. J., Thomas, L. C., Unver, T., Iredell, J. R. Rapid identification of Gram-positive pathogens and their resistance genes from positive blood culture broth using a multiplex tandem RT-PCR assay. J. Med. Microbiol. 62 (2), 223-2231 (2013).
    14. Saffert, R. T., Cunningham, S. A., Mandrekar, J., Patel, R. Comparison of three preparatory methods for detection of bacteremia by MALDI-TOF mass spectrometry. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 73 (1), 21-26 (2012).
    15. Consoir, C., Lörch, D., Schneider, C. Direct identification of bacteria from charcoal-containing blood culture bottles using matrix-assisted laser desorption/ionisation time-of-flight mass spectrometry. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 31 (10), 2843-2850 (2012).
    16. Martiny, D., Dediste, A., Vandenberg, O. Comparison of an in-house method and the commercial Sepsityper™ kit for bacterial identification directly from positive blood culture broths by matrix-assisted laser desorption-ionisation time-of-flight mass spectrometry. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 31 (9), 2269-2281 (2012).
    17. Moussaoui, W., et al. Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry identifies 90% of bacteria directly from blood culture vials. Clin Microbiol Infect. 16 (11), 1631-1638 (2010).
    18. Novel,, et al. improved sample preparation for rapid, direct identification from positive blood cultures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry. J. Mol. Diagn. 13 (6), 701-706 (2011).
    19. Fothergill, A., Kasinathan, V., Hyman, J., Walsh, J., Drake, T., Wang, Y. F. Rapid Identification of Bacteria and Yeasts from Positive-Blood-Culture Bottles by Using a Lysis-Filtration Method and Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrum Analysis with the SARAMIS Database. J. Clin. Microbiol. 51 (3), 805-809 (2013).

    Tags

    علم المناعة، العدد 87، عصيات سلبية الغرام، ثقافة الدم، وعدوى مجرى الدم، وتجرثم، MALDI-TOF، مطياف الكتلة
    التعرف السريع على البكتيريا سالبة الجرام من ثقافة الدم في مرق عن طريق MALDI-TOF الطيف الكتلي
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Gray, T. J., Thomas, L., Olma, T.,… More

    Gray, T. J., Thomas, L., Olma, T., Mitchell, D. H., Iredell, J. R., Chen, S. C. A. Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (87), e51663, doi:10.3791/51663 (2014).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter