MALDI-TOF質量分析法を使用した血液培養ブロスからのグラム陰性菌の迅速な同定
Summary
直接血培養液への航空券のマトリックス支援レーザー脱離/イオン化時間（MALDI-TOF）質量分析（MS）の適用は、細菌の同定を促進。提示した方法は、血液培養ブロスから直接、グラム陰性細菌の同定のための迅速かつ信頼できる方法である。
Abstract
臨床微生物学研究室の重要な役割は、血流感染を引き起こす細菌の迅速な同定を提供することです。伝統的な識別は、固体寒天上のコロニーが成熟した後でのみ利用可能な識別を合図血液培養液の継代培養を必要とします。 MALDI-TOF MSは、固体培地上のコロニーに適用される臨床的に関連する大部分の細菌の同定のための信頼性のある、迅速な方法である。それは、細菌の種の同定を促進し、臨床管理を改善する可能性を有するとして直接血液培養ブロスへのMALDI-TOF MSの適用は魅力的なアプローチである。しかし、克服すべき重要な問題は、除去されない場合、MSスペクトルに干渉し、不十分なまたは低判別識別スコアをもたらすことができる血液培養検体中に含まれる樹脂の妨害、タンパク質、およびヘモグロビンの分析前の除去である。それに加えてバクターを濃縮する必要があるIA十分な品質のスペクトルを開発する。提示された方法は、濃縮、精製、及び合図血液培養液からの細菌の早期発見を可能にし、グラム陰性菌の抽出について説明します。
Introduction
原因細菌に血流感染（BSI）の患者は、6〜48％1に至るまで、高い院内死亡率を持ち続ける。適切な経験的抗生物質の送達は、生存を促進し、重症敗血症の患者のサブセットでは、適切な治療への各時間の遅延が生存2,3の低下と相関する。従って、臨床検査室の主な目的は、迅速に検出、同定および臨床決定を通知するために、血液培養物中の細菌の存在を伝えることである。これは、微生物学研究室は、グラム染色4を報告し、最近時の抗菌療法に最も大きな影響を与える、観察研究は、飛行時間型質量分析法（MALDI-TOF MS）のマトリックス支援レーザー脱離/イオン化時間を実証したことが実証されている血液培養ブロス上で直接実行グラム陰性菌5に起因するBSIの三分の一以上で処方に影響する。
<p class=「jove_content "> MALDI-TOF MSの商業的開発は、微生物6,7の同定のための有効な実験室ツールにつながっている。技術は、現在十分に確立されており、固体培地の6,8で単離した微生物の迅速かつ正確な同定のための多くの研究所に統合されました。血液培養のための低コストでの微生物の初期の識別を取得する可能性の両方の臨床医や研究室の管理者への微生物のアピールのために「陽性」合図している（BC）ブロスにMALDI-TOF MSの直接適用。血液培養ブロスへのMALDI-TOF MSの直接適用の臨床的有用性は、47から98.9の範囲のグラム陰性細菌の同定の成功の報告と、識別の標準的な表現型の培養ベースの方法と比較した場合に観察される感度の広い範囲によって制限されてきた％9月11日 。感度の変動性が高いBCブロス組成物、初期細菌濃度、サンプル調製法の変動ならびに試験集団9において遭遇するグラム陰性生物体のアレイに関する。これらの他の公開されたプロトコルと比較して、ここで提示した方法は、エタノール、塩化アンモニウムまたは追加の（非マトリックス）アセトニトリルの使用を回避する。その結果、細菌ペレットは、潜在的な表現型感受性試験法は培養液中で、これらの生物に直接適用することを可能にする（タンパク質抽出の時点まで）の実行可能なままになります。また、提示された方法は、時間12最小限の'実践'で、血液培養グラム染色結果の25分以内に利用可能な細菌同定と、安価で信頼性が高く、迅速であることが示されている。
この方法では、ギ酸抽出を利用した単純な社内スピン溶解プロトコルは、グラム負のbを同定するために陽性の血液培養液に直接適用さMALDI-TOF MS技術とacteria。
Protocol
「陽性」として1。血液培養ブロス旗
- 継続的な監視のインキュベーションキャビネットから合図血液培養ボトルを取り外し、生物学的安全キャビネットに入れてください。注：ボトルは、危険な微生物を含むことができ、ユニバーサル予防措置に従わなければする必要があります。サンプリングによるエアロゾル中の感染リスクに、すべてのサンプリング手順は、バイオセーフテ?…
Representative Results
生成されたMALDI-TOF MSスペクトルは、スペクトルの集積参照データベースと比較される。対数スコアは、試験分離株の間の一致の信頼のために割り当てられ、参照データベースは分離し、種への可能性を識別するための属レベル（ 図1）と≥2.0に足りる相当の識別（ 図に必要なスコア≥1.7の勧告にされている2）。スコア≥1.7と入力ソフトウェアで一致した…
Discussion
ポストの遠心操作は分離された成分をリミックスしない十分な注意を払って行われた血液培養液にMALDI-TOF MSを適用するときには重要です。これは、MALDI-TOFスペクトルに干渉スパイクを生成することができる、ヘモグロビンを含む血液培養成分およびヒト細胞タンパク質を除去することが特に重要である。
MSは種のための≥2.0のスコアのカットや属同定のための≥1.7を推?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| BACTEC Plus Aerobic/F Medium | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 442192 | |
| BACTEC Lytic/10 Anaerobic /F Medium | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 442265 | |
| BACTEC Peds Plus Medium | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 442194 | |
| Vacutainer – Blood transfer device | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 364880 | Single use sampling device reducing the risk of needlestick injury |
| Vacutainer SST 5.0mL, Advance plus | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 367954 | Serum separating tube |
| Syringe 10 mL | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 302143 | |
| Transfer pipette | Samco, USA | 222-20S | |
| Transfer pipette (fine tipped) | Samco, USA | 232-20S | |
| Microcentrifuge tube (2.0 mL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | 0030.120.094 | |
| Sterile water (DNAse and RNAse free) | Life Technologies, Carlsbad, California, USA | 10977-015 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | F0507 | |
| Matrix solution | Bruker Daltonics, Bremen Germany | 285074 | 10 mg/ml α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, 50% acetonitrile, 2.5% trifluoroacetic acid |
| Benchtop microflex LT MALDI-TOF MS | Bruker Daltonics, Bremen Germany | Utilizing BioTyper 3.1 (Build 65) and FlexControl 3.3 (Build 99) software |
References
- Bearman, G. M., Wenzel, R. P. Bacteremias: a leading cause of death. Arch. Med. Res. 36 (6), 646-659 (2005).
- Leibovici, L., Shraga, I., Drucker, M., Konigsberger, H., Samra, Z., Pitlik, S. D. The benefit of appropriate empirical antibiotic treatment in patients with bloodstream infection. J. Intern. Med. 244 (5), 379-386 (1998).
- Kumar, A., et al. Duration of hypotension before initiation of effective antimicrobial therapy is the critical determinant of survival in human septic shock. Crit. Care Med. 34 (6), 1589-1596 (2006).
- Munson, E. L., Diekema, D. J., Beekmann, S. E., Chapin, K. C., Doern, G. V. Detection and treatment of bloodstream infection: laboratory reporting and antimicrobial management. J. Clin. Microbiol. 41 (1), 495-497 (2003).
- Clerc, O., Prod’hom, G., Vogne, C., Bizzini, A., Calandra, T., Greub, G. Impact of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry on the Clinical Management of Patients With Gram-negative Bacteremia: A Prospective Observational Study. Clin. Infect. Dis. 56 (8), 1101-1107 (2013).
- Dekker, J. P., Branda, J. A. . MALDI-TOF Mass Spectrometry in the Clinical Microbiology Laboratory. Clinical Microbiology Newslette. 33 (12), 87-93 (2011).
- Seng, P., et al. Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin. Infect. Dis. 49 (4), 543-551 (2009).
- Neville, S. A., et al. Utility of matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry following introduction for routine laboratory bacterial identification. J. Clin. Microbiol. 49 (8), 2980-2984 (2011).
- Schmidt, V., Jarosch, A., März, P., Sander, C., Vacata, V., Kalka-Moll, W. Rapid identification of bacteria in positive blood culture by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 31 (3), 311-317 (2012).
- March-Rosselló, G. A., Muñoz-Moreno, M. F., de Urriés, M. C., Bratos-Pérez, M. A. A differential centrifugation protocol and validation criterion for enhancing mass spectrometry (MALDI-TOF) results in microbial identification using blood culture growth bottles. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 32 (5), 699-704 (2012).
- Christner, M., Rohde, H., Wolters, M., Sobottka, I., Wegscheider, K., Aepfelbacher, M. Rapid identification of bacteria from positive blood culture bottles by use of matrix-assisted laser desorption-ionization time of flight mass spectrometry fingerprinting. J. Clin. Microbiol. 48 (5), 1584-1591 (2010).
- Gray, T. J., Thomas, L., Olma, T., Iredell, J. R., Chen, S. C. Rapid identification of Gram-negative organisms from blood culture bottles using a modified extraction method and MALDI-TOF mass spectrometry. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 72 (2), 110-112 (2013).
- Hazelton, B. J., Thomas, L. C., Unver, T., Iredell, J. R. Rapid identification of Gram-positive pathogens and their resistance genes from positive blood culture broth using a multiplex tandem RT-PCR assay. J. Med. Microbiol. 62 (2), 223-2231 (2013).
- Saffert, R. T., Cunningham, S. A., Mandrekar, J., Patel, R. Comparison of three preparatory methods for detection of bacteremia by MALDI-TOF mass spectrometry. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 73 (1), 21-26 (2012).
- Consoir, C., Lörch, D., Schneider, C. Direct identification of bacteria from charcoal-containing blood culture bottles using matrix-assisted laser desorption/ionisation time-of-flight mass spectrometry. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 31 (10), 2843-2850 (2012).
- Martiny, D., Dediste, A., Vandenberg, O. Comparison of an in-house method and the commercial Sepsityper™ kit for bacterial identification directly from positive blood culture broths by matrix-assisted laser desorption-ionisation time-of-flight mass spectrometry. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 31 (9), 2269-2281 (2012).
- Moussaoui, W., et al. Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry identifies 90% of bacteria directly from blood culture vials. Clin Microbiol Infect. 16 (11), 1631-1638 (2010).
- Novel, , et al. improved sample preparation for rapid, direct identification from positive blood cultures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry. J. Mol. Diagn. 13 (6), 701-706 (2011).
- Fothergill, A., Kasinathan, V., Hyman, J., Walsh, J., Drake, T., Wang, Y. F. Rapid Identification of Bacteria and Yeasts from Positive-Blood-Culture Bottles by Using a Lysis-Filtration Method and Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrum Analysis with the SARAMIS Database. J. Clin. Microbiol. 51 (3), 805-809 (2013).
