Combinatorias 5 proteínas fluorescentes de marcado de las células madre y progenitoras hematopoyéticas permite in vivo seguimiento clonal a través confocal y microscopía de dos fotones, que proporciona conocimientos sobre la médula ósea hematopoyética arquitectura durante la regeneración. Este método permite la correlación de destino no invasiva de las células derivadas de HSPCs espectralmente-codificados en tejidos intactos durante largos períodos de tiempo después del trasplante.
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Artículo de método
En Tracking Clonal vivo de madre hematopoyéticas y células progenitoras Marcado por cinco proteínas fluorescentes utilizando confocal y Microscopía Multifotónica
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Resumen
Resumen
Hemos desarrollado y validado un marcador fluorescente metodología para el seguimiento clonal de las células madre y progenitoras hematopoyéticas (hspCs) con alta resolución espacial y temporal para estudiar en la hematopoyesis in vivo usando el trasplante de médula ósea modelo experimental murino. Combinatoria genética marcado utilizando vectores lentivirales que codifican proteínas fluorescentes (FPS) permitió la cartografía destino celular a través de imágenes de microscopía avanzada. Vectores que codifican cinco programas marco diferentes: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato y mCherry se utilizaron para transducir simultáneamente HSPCs, creando una paleta diversa de células de color marcado. Imaging utilizando microscopía confocal híbrido / dos fotones permite la evaluación de alta resolución simultánea de las células marcadas de forma única y su progenie en conjunción con componentes estructurales de los tejidos. Volumétrica analiza en grandes áreas revelan que las células derivadas de HSPC espectralmente codificados se pueden detectar de forma no invasiva en diversos tejidos intactos, incluyendo la médula ósea (BM), Durante largos períodos de tiempo después del trasplante. Los estudios en vivo que combinan multifotón-velocidad de vídeo y time-lapse confocal en 4D demuestran la posibilidad de rastreo celular y clonal dinámico de una manera cuantitativa.
Introducción
La producción de células sanguíneas, denominado hematopoyesis, es mantenida por una pequeña población de células madre y progenitoras hematopoyéticas (hspCs). Estas células residen dentro de la médula ósea (BM) en un complejo que consiste nicho microambientales de los osteoblastos, células del estroma, tejido adiposo, y las estructuras vasculares, todos implicados en el control de la auto-renovación y diferenciación 1,2. Como BM intacto ha sido tradicionalmente inaccesibles a la observación directa, las interacciones entre HSPC y su microambiente sigue siendo en gran medida sin caracterizar in vivo. Anteriormente, hemos establecido una metodología....
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Protocolo
Todos los ratones fueron alojados y manipulen de conformidad con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud, y se inscribió en un protocolo aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales NHLBI. Mujer B6.SJL-PTPRC (d) Pep3 (b) / BoyJ (B6.SJL) y ratones C57BL / 6, 6-12 semanas de edad, fueron utilizados como donante y receptor, respectivamente.
Una lista de materiales, reactivos y equipo se proporciona en la Tabla 1.
1. LEGO Transducción de Ratón HSPCs y Trasplante de Médula Ósea
Lleve a cabo los procedimientos d....
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Resultados
Todo el montaje 3D confocal / 2 fotones microscopía reconstrucciones del curso esternal tiempo médula ósea reveló el injerto y la expansión de los compañeros de 5fps trasplantadas en un modelo con características notables: clones aparecieron claramente delimitada, homogénea marcados con amplia paleta de colores inicialmente y el progreso con el tiempo para contener preferentemente a las células de la mayoría de un solo color. La microscopía confocal de configuración y ejemplos representativos de formación de imágenes 5f.......
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Discusión
Se describen aquí los detalles de una metodología poderosa recientemente ideado para el seguimiento celular clonal, la combinación de la gran diversidad generada por el marcado con vectores que codifican LEGO 5PM-y de formación de imágenes confocal con tándem y microscopía de 2 fotones para lograr volumétrica y la imagen dinámica en los tejidos vivos combinatoria. Esto se extendió el uso del color basados en FP marcado por la grabación de la identidad espectral confocal en 5 "distintos" canales de 8 bits. As.......
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Divulgaciones
Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigación Intramuros del Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre de los Institutos Nacionales de Salud. Agradecemos a Boris Fehse (Centro Médico Universitario de Hamburgo-Eppendorf, Hamburgo, Alemania) por proporcionar los cinco plásmidos vectoriales LeGO; Christian A. Combs y Neal S. Young (NHLBI, NIH) por sus conversaciones, apoyo y aliento a lo largo de este estudio, y Andre LaRochelle (NHLBI, NIH) por su ayuda con las inyecciones en las venas de cola.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Producción de virus | |||
| LeGO-Cer2 | Addgene | 27338 | cerúleo |
| Addgene | 25917 | Expresión de eGFP | |
| LeGO-V2 | Addgene | 27340 | Expresión de Venus |
| LeGO-T2 | Addgene | 27342 | Expresión de tdTomato |
| LeGO-C2 | Addgene | 27339 | Expresión de mCherry Kit de |
| transfección de fosfato de calcio | Sigma | CAPHOS-1KT | |
| Placa de cultivo de tejidos | BD Falcon | 353003 | |
| IMDM | Gibco, Life Technology | 12440-053 | |
| Suero fetal bovino inactivado por calor Sigma | F4135-500ML | ||
| Pluma Estreptococo Glutamina | Gibco, Vida Tecnología | 10378-016 | |
| Tubos de centrífuga | Beckman Coulter | 326823 | |
| SW28 Ultracentrífuga | Beckman Coulter | L60 | |
| Millex Jeringa Accionada por Filtro Unite (0.22 µ m) | Millipore | SLGS033SS | |
| Mouse Cell Collection, Purification, Transduction, and Transplantation | |||
| ACK lysing | Quality Biologicals Inc. | 118-156-101 | |
| Kit de depleción de células de linaje (ratón) | Miltenyi Biotec Inc. EE. UU. | 130-090-858 | |
| LS columnas + tubos | Miltenyi Biotec Inc. EE. UU. | 130-041-306 | |
| Filtros de preseparación (30 µ m) | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-041-407 | |
| StemSpan SFEM medio libre de suero para el cultivo y la expansión de células hematopoyéticas (500 ml) | StemCell Technologies Inc | 9650 | |
| Murine IL-11 CF | R & D Systems Inc | 418-ML-025/CF | 100 y micro; g/ml es 1.000 veces |
| SCF murino recombinante | División RDI de Fitzgerald Industries Intl | RDI-2503 | 100 y micro; g/ml es 2.000x |
| IL-3 murino recombinante | R & D Systems Inc | 403-ML-050 | 20 µ g/ml es 2.000x |
| FLT-3 Ligando | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-096-480 | 100 µ g/ml son 1.000 |
| placas de 12 pocillos, Costar | Corning Inc. | 3527 | |
| Retronectin | Takara Bio Inc | T100A/B | Resuspender a 50 µ g/ml |
| Sulfato de Protamina | Sigma | P-4020 | 4 µ g/ml es 1,000x |
| Microscopía confocal y de dos fotones | |||
| DMEM | Lonza | 12-614F | |
| 1 M Hepes | Cellgro, Mediatech Inc. | 25-060-CI | |
| Placa de cultivo con fondo de vidrio P35G-0-20-C | MatTek Corporation | P35G-0-20-C | |
| Placa de cultivo con fondo de vidrio P35G-0-14-C | MatTek Corporation | P35G-0-14-C | |
| Nunc Lab-Tek Cubreobjetos con cámara #1 Cubreobjetos de borosilicato; | Thermo Scientific | 155383 | |
| 22 mm Nº 2 | Thomas Scientific | 6662-Q55 | |
| Microscopio confocal y multifotónico Leica TCS SP5 AOBS de cinco canales | Leica Microsystems | ||
| 680-1.080 nm | Camaleón | ||
| coherente Gama de láser OPO compacta 1.030-1.350 nm | de | ||
| /0,95 NA coherente (WD=2,5 mm) | Leica Microsystems | ||
| Objetivo seco HC-PLAPO-CS 20X/0.70 NA (WD=0.6 mm) | Leica Microsystems | ||
| HC-PL-IRAPO 40X/1.1 NA (WD=0.6 mm) | Software Leica Microsystems | ||
| Imaris versión 7.6 | Bitplane |
Referencias
- Lo Celso,, C,, Scadden, D. T. The haematopoietic stem cell niche at a glance. J Cell Sci. 124, 3529-3535 (2011).
- Lo Celso, C., et al. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457, 92-96 (2009).
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Reimpresiones y permisos
Erratum
Formal Correction: Erratum: In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.
A correction was made to In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy. At the time of publication, there was a typo in the discussion, which displayed an incorrect depth.
This was corrected in the discussion from:
This approach combines the benefits of single-cell resolved high resolution imaging together with optical sectioning via confocal microscopy. Very large x - y (mm2) regions of the intact dense tissue volume can be examined by generating tiled-images. These high resolution images from optical sections can be used to computationally reconstruct (automatically and “on-the-fly”) complete 3D volumes of great complexity to depths of ~ 30 μm, comprising ~ 20-30 layers of cells, vascular, bone and collagen structures. 3D reconstructions can be used for morphometric non-invasive quantitative analyses of biologic interest. One important caveat to point out is that large volume/high resolution imaging is time-consuming, for instance 1 hr per ~1 mm3 of tissue (one fossae of the sternum), therefore we recommend imaging no more than 1 mouse per experiment per day when bone marrow as well as different tissues need to be examined in detail.
to:
This approach combines the benefits of single-cell resolved high resolution imaging together with optical sectioning via confocal microscopy. Very large x - y (mm2) regions of the intact dense tissue volume can be examined by generating tiled-images. These high resolution images from optical sections can be used to computationally reconstruct (automatically and “on-the-fly”) complete 3D volumes of great complexity to depths of ~ 300 μm, comprising ~ 20-30 layers of cells, vascular, bone and collagen structures. 3D reconstructions can be used for morphometric non-invasive quantitative analyses of biologic interest. One important caveat to point out is that large volume/high resolution imaging is time-consuming, for instance 1 hr per ~1 mm3 of tissue (one fossae of the sternum), therefore we recommend imaging no more than 1 mouse per experiment per day when bone marrow as well as different tissues need to be examined in detail.
