Flaskhalsen för cellulära 3D elektronmikroskopi är feature extraction (segmentering) i mycket komplexa 3D densitetskartor. Vi har utvecklat ett antal kriterier, som ger vägledning om vilka segmente strategi (manuell, halvautomatisk eller automatisk) lämpar sig bäst för olika datatyper, vilket ger en utgångspunkt för effektiv segmentering.
Moderna 3D elektronmikroskopiska metoder har nyligen tillåtet motstycke inblick i 3D ultrastrukturell organisation av celler och vävnader, vilket möjliggör visualisering av stora makromolekylära maskiner, såsom vidhäftningskomplex, såväl som högre ordningens strukturer, såsom cytoskelettet och cellulära organeller i deras respektive cell och vävnad sammanhang. Med tanke på den inneboende komplexiteten av cellulära volymer, är det viktigt att först extrahera egenskaper av intresse för att möjliggöra visualisering, kvantifiering, och därmed förstå deras 3D-organisation. Varje datauppsättning definieras av olika egenskaper, till exempel, signal-brusförhållande, skärpa (skärpa) av uppgifterna, heterogenitet av dess funktioner, trängsel funktioner, närvaro eller frånvaro av karakteristiska former som möjliggör enkel identifiering, och procent av hela den volym som en viss region av intresse upptar. Alla dessa egenskaper måste beaktasnär beslut fattas om vilka närmar ta för segmentering.
De sex olika 3D-apparater ultra uppgifter som presenteras erhölls genom tre olika bild närmar: harts inbäddade målat elektron tomografi, fokuserad jon BEAM och serieblock ansikte-svepelektronmikroskop (FIB-SEM, SBF-SEM) av milt färgade och starkt färgade prover , respektive. För dessa datamängder, har fyra olika segmenteringsmetoder använts: (1) helt manuell modellbygge följt enbart av visualisering av modellen, (2) manuell spårning segmentering av data följt av ytan rendering, (3) halvautomatiska metoder följs genom ytan rendering, eller (4) automatiserade skräddarsydda segmente algoritmer följt av ytan rendering och kvantitativ analys. Beroende på kombinationen av data set egenskaper, visade det sig att oftast en av dessa fyra kategoriska synsätt utklassar de andra, men beroende på den exakta sekvensen av kriterier, more än en strategi kan vara framgångsrik. Baserat på dessa data, föreslår vi ett triage system som kategoriserar både objektiva data set egenskaper och subjektiva personliga kriterier för analys av de olika datamängder.
Traditionellt elektronmikroskopi (EM) fält har delats upp i 1) i strukturbiologi grenen använder hög och super-hög upplösning TEM, oftast i kombination med implicita eller explicita uppgifter genomsnitt att undersöka tredimensionella (3D) struktur makromolekylära komplex med en definierad sammansättning och vanligen en relativt liten storlek 1-4, och 2) den cellulära avbildning grenen där hela cellulära scenerier visualiseras 1,5,6. Medan strukturbiologi filialen har genomgått en spektakulär utveckling under de senaste fyra decennierna, var cellbiologi grenen oftast begränsad till två dimensioner, ofta på mindre än optimalt bevarade prover. Endast med tillkomsten av elektron tomografi under det senaste decenniet har cellbiologiska ultra imaging expanderat till den tredje dimensionen 5,7, där typiska genomsnitt kan inte utföras eftersom de cellulära scenerier, och därmed de egenskaper av intresse, är vanligtvis unika.
Även visualiseras cellulära scener är ofta fantastisk för ögat, effektiv extrahering av funktionerna i intresse och efterföljande kvantitativ analys av sådana extremt komplexa cellulära volymer släpar efter, delvis på grund av att exakta proteinsammansättningen är oftast okänd, vilket gjorde det svårt att tolka dessa cellulära 3D-volymer. Till detta datum, krävs ofta omfattande biologisk expertis för att tolka komplexa tomogram, eller till och med att identifiera viktiga områden och väsentliga komponenter i 3D-volymen. Som en ytterligare komplikation är visualisering av 3D-volymer anmärkningsvärt icke-trivial. 3D-volymer kan ses och på så sätt visualiseras som travar av 2D-bilder. Slice-för-bit inspektion av sekventiella 2D-bilder minskar komplexiteten, men också gränser har utvinning och därmed kvantitativ analys till de två dimensionerna. Men för de flesta 3D-objekt, som enbart en stapel av på varandra följande plan leder skildringen av 3D-volymer till ett ofullständigt end skeva perspektiv i ett visst system 3D natur. Alternativa former av visuell inspektion kräver antingen volymrendering eller yta rendering, som-med tanke på den ofta täta karaktären av en cellulär volym kan lätt leda till en snedvriden bild av kapslade objekt eller överväldiga en användare helt och hållet, vilket gör interaktiv manuell segmente svårt.
För att åtgärda dessa hinder, ett stort utbud av automatiserade feature extraction har (segmente) metoder utvecklats som är typiskt antingen densitets eller gradient-baserade 8-10. Men dessa metoder tenderar att segment hela volymen oavsett vilka områden eller funktioner är av intresse för den sakkunnige, även om vissa nya metoder kan rikta en viss funktion av intresse såsom aktinfilament 11. Dessutom kan de program som utför automatisk segmentering ibland resultera i produktion av ett stort antal under volymer (t ex vid tillämpningen vattendelare immersion segmente) som ofta måste slås samman för hand tillbaka in omfattar hela funktionen av intresse eller underkastas ytterligare segmentering. Detta gäller framför allt för komplexa och trångt datamängder, vilket mest rendering datoralgoritmer inte kan extrahera endast de funktioner av intresse med trohet och betydande curation insatser av en expert behövs ofta för att producera en önskad segmenterad volym.
Dessutom är anpassade lösningar till ett mycket specifikt problem ofta publiceras som ett vetenskapligt möte papper, med liten eller ingen vikt vid att göra dem brett och omfattande verktyg tillgängliga för forskare som inte har ingående kunskap om områdena matematik, datavetenskap och / eller datorgrafik. En anpassningsbar programmeringsmiljö, som innehåller en rad bibliotek bildanalys, kan vara ett kraftfullt verktyg som tillåter användare att effektivt skriva egna moduler för noggrann segmentering. Detta kräver dock tillvägagångssätt extensive utbildning och en bakgrund inom datavetenskap för att dra nytta av dess många funktioner eller funktioner för bildanalys. Man kan arbeta inom ett så mångsidigt programvarumiljö för vissa datamängder där funktionerna är mer gles, t.ex. genom att utnyttja kraftfulla formbaserade strategier som förlitar sig på den unika geometri "mallar" för att åtskilja föremål av intresse från omgivningen 12,13 .
En rättvis mängd datorgrafik visualiseringspaket finns för interaktiv manuell segmentering och modellbygge. Vissa paket är kommersiellt tillgängliga, medan andra är av akademiskt ursprung och distribueras gratis, till exempel: University of California San Francisco Chimera 14, University of Colorado IMOD 15, och University of Texas i Austin VolumeRover 16. Men de många och komplexa funktioner och möjligheter dessa program besitter brantare inlärningskurva för each. Vissa program visualisering ger enkla geometriska modeller, såsom bollar och pinnar i olika storlekar, som kan placeras in i densitetskartor för att skapa en förenklad modell av den komplexa 3D-volymen. Dessa modeller kan sedan enkla geometriska och volymmätningar och därmed gå längre än bara "vacker bild". Sådan manuell spårning av objekt fungerar bra för volymer där endast ett litet antal objekt måste spåras och extraheras. Men den senaste tidens utveckling av stor volym 3D ultra avbildning med antingen fokuserad jonstråle svepelektronmikroskop (FIB-SEM) 17-20 eller serieblock ansikte svepelektronmikroskop (SBF-SEM) 21 presenterar ytterligare komplikation att storleken på 3D-data uppsättningar kan vara allt från gigabyte till tiotals och hundratals gigabyte, och även terabyte. Därför så stora 3D-volymer är praktiskt taget oåtkomlig för manuell funktion utvinning och därmed effektiv användar guidad halvautomatiskt bedrifture utvinning blir en av flaskhalsarna för effektiv analys av 3D-volymer inom överskådlig framtid.
Här presenteras fyra olika segmenteringsmetoder som rutinmässigt används på ett stort utbud av biologiska bildtyper. Dessa metoder jämförs sedan för sin effektivitet för olika typer av datamängder, vilket gör en sammanställning i en guide för att hjälpa biologer avgöra vad som kan vara den bästa segmente metod för effektiv funktion utvinning av sina egna uppgifter. Som detaljerade användarmanualer finns för de flesta av de program som beskrivs, är syftet inte att göra potentiella användare känner till någon av dessa speciella förpackningar. Istället är målet att demonstrera respektive styrkor och begränsningar hos dessa olika segmenteringsstrategier genom att tillämpa dem på sex exempel datamängder med olika egenskaper. Genom denna jämförelse, har en uppsättning kriterier utvecklats som antingen bygger på de objektiva bildegenskaper3D-data, såsom uppgifter kontrast, skärpa, trängsel, och komplexitet, eller härstammar från subjektiva överväganden, såsom det önskade målet för segmentering, morfologier av funktionerna ska fördelas, befolkningstäthet av funktionerna i ränta, vilket innebär att den del av volymen upptas av funktionen av intresse, och hur en vinning optimalt med ändliga resurser som tid och tillgång på personal. Dessa olika exempeldatauppsättningar illustrerar hur dessa objektiva och subjektiva kriterier kan appliceras sekventiellt i en mängd olika kombinationer för att ge en ihopkoppling av vissa feature extraction metoder med vissa typer av datauppsättningar. Rekommendationerna kommer förhoppningsvis hjälpa nybörjare inför en mängd olika segmenteringsalternativ att välja den mest effektiva segmente strategi för sin egen 3D-volym.
Medan fokus i denna uppsats är feature extraction, uppmärksamhet på datainsamling och förbehandling uppgifter är avgörande för effektiva segmentation. Ofta färgning av prover kan vara ojämn, och därför bör potentiella färgningsartefakter beaktas i segmenteförfarandet. Emellertid fläck ger vanligtvis högre signal-till-brus, och kräver därför mindre filtrering och annan matematisk behandling av cellulära volymer, vilket potentiellt också kan resultera i artefakter. Respektive Raw datamängder måste förvärvas på rätt kontrast och kamera pixelinställningar, linje, och rekonstrueras i en 3D-volym. För tomogram, är i linje bilderna rekonstrueras vanligtvis använder viktade back-projektion, och sedan datauppsättningen brukar genomgå denoising algoritmer såsom icke-linjära anisotropa diffusion 22, bilateral filtrering 23 eller rekursiv medianfiltrering 24. FIB-SEM och SBF-SEM bilddata är i linje med korskorrelera varandra följande skivor i XY utnyttjar program som ImageJ 25. Kontrastförstärkning och filtrering kan appliceras för att öka funktionerna iintresse och på så sätt att de-brus bildstacken. Filtrering kan utföras antingen på hela volymen före delvolymen val eller på de valda subvolymer, eftersom filtreringsmetoder kan vara resurskrävande. Down-sampling av data (Binning), som ibland används för brusreducering och / eller fil storleksminskning, rekommenderas endast om uppgifterna har betydligt översamplade jämfört med den förväntade upplösningen.
Efter brusreducering, kan de bearbetade bilderna sedan segmenteras genom olika metoder, och fokus i denna studie ligger på följande fyra: (1) manuell abstraherade modell generation genom att skapa en boll och piska modell (2) manuell spårning funktioner av intresse, (3) automatisk tröskelbaserad densitet och (4) skräddarsydda automatiserade segmente via ett manus till projektspecifik segmentering. Boundary segmente 8 och uppslukande vattendelare segmente 10 finns bättre alternativ till enkla tröskel, men thej tillhör samma kategori och har inte uttryckligen tagits med i denna diskussion.
Manuell spårning av tätheter kräver beskriver de funktioner av intresse, skiva-för-skiva, vilket gör det möjligt att behålla den ursprungliga densiteten för respektive undercellulära områden. Detta tillvägagångssätt gör maximal kontroll över segmenteringsprocessen, men är en mödosam och arbetsintensiv process.
Automatiserade tröskelbaserade (och relaterade) densitet segmente metoder är halvautomatisk, där en algoritm väljer bildpunkter bygger på en uppsättning användardefinierade parametrar. Flera akademiska (gratis) visualiseringspaket, till exempel UCSF Chimera, IMOD, Fiji 26, och VolumeRover finns tillgängliga, samt kommersiella (kräver betalda licenser) paket, och båda typer är vanligtvis en eller flera av dessa segmente metoder. Mjukvaruprogram som används i detta arbete för att illustrera dessa olika metoder inkluderar både kommersiella program och akademiska öppna sOurce program för manuellt generera en abstrakt modell, samt manuella och automatiserade densitet segmente. Däremot kan öppen källkod ibland erbjuda mer avancerade alternativ genom möjligheten till anpassning.
En jämförelse av dessa tekniker som använder olika typer av datamängder ledde till följande presentation av regler och vägledning om hur man skall närma segmentering av olika biologiska data 3D volymer, vilket enligt vår kännedom har ännu inte publicerats. Således är detta den första systematiska jämförelsen av de olika metoder och deras användbarhet på datamängder med olika egenskaper för användare med olika syften.
Effektiva strategier för utvinning av relevanta funktioner från 3D EM volymer akut behov för att hålla jämna steg med de data tsunami som nyligen har drabbat biologisk avbildning. Även data kan genereras i timmar eller dagar, tar det flera månader att analysera 3D-volymerna på djupet. Därför är det klart att bildanalysen har blivit en flaskhals för vetenskapliga upptäckter; utan tillräckliga lösningar på dessa problem, imaging forskarna blir offer för sin egen framgång. Detta beror delvis på grund av den höga komplexiteten av data och även makromolekylära trängsel normalt återfinns i biologiska celler, där proteiner och proteinkomplex angränsar varandra och i huvudsak uppträder som en kontinuerlig gradient av gråskala densiteter. Problemet kompliceras av beredning och bildprovet brister, och i vissa fall bildrekonstruktions artefakter, vilket leder till mindre än perfekt volymuppgifter som kan innebära utmaningar för helautomatisk metodes. Mest betydande är dock det faktum att experter i provberedning, bildbehandling och den biologiska tolkningen sällan väl bevandrad i beräkningsvetenskap, och därmed kräver vägledning om hur man effektivt närma funktion extraktion och analys. Därför hjälp av olika exempel, förklarar protokollet hur man förbereder data för segmentering samt stegen för manuell abstraherade modell generation, automatiserad täthetsbaserad segmentering, manuell spårning av funktioner i intresse och skräddarsydd automatisk segmentering. De manuella och automatiska metoder som beskrivs i förfarandet finns i en mängd olika segmente mjukvara, varav några nämns här, men andra utför liknande funktioner och är lika väl lämpade.
Resultaten visar att effekten av var och en av 3D-segmenteringsmetoder varierar för varje typ av datamängder. Även om de olika metoder som produceras kvalitativt similar 3D renderingar som slutprodukten, den tid och ansträngning läggs på var och under segmenteringsprocessen varierade kraftigt. Rekommendationerna för lämpliga bildegenskaper och personliga mål per segmente synsätt sammanfattas i Figur 5, vilket ytterligare förklaras i de följande fyra avsnitten. Dessa kriterier tillämpas på de sex dataset, vilket framgår av beslutet flödesschemat i figur 6. Även om figurerna 5 och 6 är enbart tänkt att ge en logisk grund för varje datamängd och hur var och en av kriterierna viktas i beslutsprocessen, de ger inte ett idiotsäkert vägledning, utan snarare en utgångspunkt. Det finns helt enkelt för många kriterier som påverkar beslutsfattandet: en del är objektiva kriterier, till exempel uppgifter set egenskaper, medan andra är mer subjektiva kriterier, såsom det önskade målet. Det är säkert att säga att datauppsättningar som visar en hög nivåel kontrast med skarpa skarpa gränser, har funktioner som är väl åtskilda och relativt homogen (inte alltför varierande) och bearbetas i syfte att visa en modell täthet för ett stort antal objekt, kommer automatiserade metoder vara överlägsen, om inte för att manuella metoder helt enkelt skulle vara resurs (tid) -prohibitive. Å andra sidan, om kontrasten är låg, är den data som otydlig och därför kräver en expert kunskap, objekten är trångt, och de funktioner visar en hög mångfald och därmed heterogena, kanske man inte har något annat val än manuell feature extraction / segmentering.
Manuell Abstracted Model Generation
Manuell abstraherade modell spårning är särskilt effektiv i segmentera linjära element, ger frön punkter (bollar) som automatiskt kan anslutas (pinnar). Sådana bollar och pinnar-modeller kan vara mycket kraftfullt för att mäta längd and orienteringen av modellen och ger en tillräckligt abstraherade modell för både kvalitativa inspektion och kvantitativ analys. Manuell abstraherade modellgenerering används ofta när minimera resurser spenderas på analysen är viktigare än absolut trohet till formerna på de ursprungliga uppgifterna. Det är mest framgångsrika med linjära och homogena funktioner av intresse (t.ex. fibrer, rör). Data kontrast, skärpa och trängsel inte spelar en viktig roll för hur den här metoden framgång, så länge som det mänskliga ögat kan känna igen föremål för intresse. Ibland sådana modeller kan också användas som ett skelett att segmentera 3D-karta i en zon runt skelettet. Även om modellen är abstrakt och inte en återspegling av exakta densiteter, innebär det en skeletonized version av 3D-täthet och därmed möjliggör plotter visualisering och kvalitativ analys. Kvantitativa mätningar såsom längd kan även bestämmas från den ungefärliga modellen. För enexempel på program med manuell abstraherade modell generation, besök Chimera detaljerade användarhandboken online på http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/current/docs/UsersGuide/index.html .
Manuell spårning av funktioner av intresse
Manuell pensel spårning fungerar bra med nästan alla datastandard, men det är också den mest tidskrävande metod. Ibland är det den enda teknik för att extrahera en del av intresse från en komplex bildserien som innehåller en stor mängd funktioner, som till exempel den tunna och invecklad cellmembran. Ett användbart verktyg som finns i vissa program gör det möjligt för interpolering mellan intermittent segmente skivor när funktionen av ränta ändras smidigt. Manuell spårning kan användas mest effektivt om uppgifterna är skarp och har medelhög till hög kontrast, men den kan också användasför mer krävande datamängder, så länge användaren är bekant med objekt av intresse. Data komplexitet kan variera från diskreta objekt till komplexa och trångt datamängder, där föremål är tätt packade. I det senare fallet kan manuell segmente vara det enda valet, som automatiska metoder kämpar ofta för att segmentet önskad volym och extrahera för mycket eller för lite. Svåra har morfologier, såsom invecklade ark eller volymer, kan också extraheras genom detta förfarande. Dock bör användaren ha i åtanke att en datamängd med flera svåra egenskaper endast kan segmenteras om befolkningstäthet av funktionerna i intresse är lågt, eftersom segmentering av hög befolkningstäthet på aspekter av intresse blir tids oöverkomliga. För ett exempel på program med manuell spårning, besök Amira detaljerade användarhandboken online på http://www.vsg3d.com/sites/default/files/Amira_Users_Guide.pdf.
Automatiserad Densitet baserad segmentering
I motsats till de manuella tekniker, de automatiserade metoder är i allmänhet mindre tidskrävande, vilket är en viktig faktor att beakta när man segmentera en stor bunt med bilder. Dock kan enkelt tröskel inte lika precis, och mycket mer tid kan läggas på förfining och säkring av automatiskt segmente volymen. Automatiserad densitetsbaserad segmentering fungerar bäst på datamängder som visar ett stort antal liknande funktioner av intresse att alla kräver segmentering. Om data är mer komplex, kan dessa automatiserade tekniker fortfarande fungera som ett första steg, men kommer sannolikt att kräva någon manuell inblandning ner linjen för att ange en delvolymen innehåller inslag av intresse. Denna strategi fungerar oftast väl på linjära morfologier eller vindlingar volymer, men det är sällan framgångsrika med tunna veckade ark såsomcellmembran. Färre användaringripanden med automatiserade metoder möjliggör segmentering genom stora eller små volymer, samtidigt som spilla några användar resurser såsom tid i utbyte mot high fidelity. För ett exempel på program med automatisk densitetsbaserad segmentering, besök Amira detaljerade användarhandboken online på http://www.vsg3d.com/sites/default/files/Amira_Users_Guide.pdf .
Skräddarsydda automatiserade segmente
Skräddarsydd automatisk segmentering gör att effekt anpassning av algoritmer för en viss datamängd, men det är ofta specifika för datamängden eller datatypen, som är lämpliga för ett begränsat antal spelegenskaper, och kan inte generaliseras lätt. Förfarandet utställningsmonter här skiljer sig från de allmänna automatiserade segmente angreppssätt som vattendelare nedsänkning och annan nivå set-metoder, som förlitar sig på en programmerad bestämning av kritiska punkter utsäde, följt av snabbt marschera kub expansion från dessa utsädes poäng. En variant på detta tema är gränssegmentering, där gradientvektorn informationen informerar funktionsgränser. Däremot anpassade skript som används här bygger på en tränings stadium där användaren spårar några exempel manuellt. Genom maskininlärning kommer särskilda algoritmer upptäcka och sedan lära sig att självständigt identifiera fastigheter och dataegenskaper gående finns i spåren. En van användare kan omskola de algoritmer och förbättra noggrannheten i segmente genom att inkludera fler exempel skrivs för att ge en större uppsättning med funktionskriterier. Sammantaget kan tröskel och relaterade strategier, eller till och med skräddarsydda strategier inte vara lika användbar för att extrahera en enstaka inslag av intresse från en bild med komplex mångfald av organeller eller former, som säkring kan vara lika arbetskrävande som manuell spårning.
">Strategier för Triaging Data och välja ett Segmente Approach
Med tanke på de subjektiva och objektiva kriterier som presenteras i Figur 4 och sammanfattning av lämpliga datamängder i figur 5, kan beslutsprocessen systemet visas i Figur 6 hjälpa en effektiv bedömning av funktion extraktion strategier för ett stort antal olika datamängder. De datamängder är gallrad i fyra på varandra följande beslut, som var och en kan innefatta någon av de fyra respektive mål samt de fyra subjektiva kriterier som införts i Figur 4. Som ett exempel, är det rationellt för triaging vardera av de sex uppgifterna Figur 6 uppsättningar visas i figur 3. Utan tvekan, för varje datamängd finns det inte en enda unik bana, utan snarare olika vägar genom denna matris efter olika kriterier för beslutsfattande som kan leda to samma eller olika rekommendationer för datasegmentering. Även om varje uppsättning data kommer att ha sin egen uppsättning egenskaper, som inte kan förutses, är sex exempel ges, varje parad med en förklaring av logiken bakom föredragna feature extraction / segmente strategi. Mest också innehålla ett förslag till en alternativ beslutsvägen som antingen leder till att använda samma eller en annan segmentering strategi (Figur 6).
Den kinocilium är en skarp datamängd med klart definierade gränser, vilket gör automatiserade metoder större chans att lyckas. Alla funktioner av intresse är väl separerade, återigen gynnar en automatiserad metod. Dessutom funktionerna i intresse är lika varandra, vilket gör det till en relativt homogen datamängd idealisk för skräddarsydd segmentering. Slutligen var målet att utvinna hela funktionen, gynnar ett halvautomatiskt strategi. Följaktligen drogs slutsatsen att en automatiserad tröskel (fast grön linje) samt ett skräddarsytt (t.ex. forma övervakad segmentering) metod (prickad grön linje) är båda benägna att göra bra på denna datamängd.
Liknande kriterier, trots att placeras i en annan ordning i beslutsfattandet nätet, gäller för fallet med bakterier. En skräddarsydd metod rekommenderas delvis eftersom denna datamängd var mycket stor; därmed begränsade resurser förbjuder en arbetsintensiv manuella ingrepp / segmente strategi. Medan tröskel skulle ha gett acceptabla resultat, den skräddarsydda tillvägagångssätt kunde verkställa studiens huvudmål att separera de rundade bakteriella former från de extracellulära metallfyndigheter, som ligger antingen i-mellan bakterierna eller intill bakterierna, och därför skräddarsydda tillvägagångssätt föredrogs.
För sinneshår datamängder, det första överväg var det önskade målet: Målet kan antingen vara att visa hela densiteteneller för att skapa geometriska modeller. Volymen av intresse var ett trångt område, och målet var att segmentera ett stort antal objekt som separerade objekt i syfte att därefter genomföra kvantitativa volymetriska analyser, inklusive längder, siffror, avstånd, riktning, etc. Det var bra att ändamålen med intresset var huvudsakligen linjära, och detta gjorde geometriska modellen spåra metod. Men om i stället syftet har varit att visa hela densitet, då den linjära funktionen morfologi samt relativt hög kontrast med skarpt definierade gränser skulle göra en automatisk tröskelprotokoll genomförbart.
De cellmembran och mitokondrier Datafall är utmanande för automatiserade metoder på grund av deras kategorier av funktionen morfologi: invecklade lakan och volymer, respektive. Målet är att spåra cellen eller mitokondrier kontur korrekt, men det finns bara ändliga resurser att göra det. Dessutom funktionerna i interest är komplexa och kan inte vara lätt upptäcks automatiskt eller form-kodad, men för mitokondrierna dataset den anpassade skript tillvägagångssätt som för bakterierna kan eventuellt appliceras med ytterligare anpassning. Lyckligtvis membranet och mitokondrierna själva bara utgör en liten del av hela volymen och därmed är en enkel om än tidskrävande metod manuell spårning. Manuell spårning är också den metoden för sådana datamängder när kontrasten är ganska låg och gränserna är ganska luddiga. Som ett resultat, även om de utgör en väsentlig del av datamängder måste sådana invecklade ark manuellt spåras, helt enkelt på grund av brist på bättre alternativ.
Anläggningen dataset ställde sina egna utmaningar eftersom målet var att segmentera alla objekt, som är tätt placerade och utgör en myllrande landskap. Visning av densitet som det är skulle möjliggöra mätningar om form och organisation av föremålen, men because manuellt segmentera varje trådformiga objekt för dyrt, automatisk tröskel användes istället.
De olika stegen och motsvarande resultat i att skapa en 3D-modell har visats här, men ännu viktigare, de egenskaper data och personliga kriterier som finns vara avgörande för att bestämma den bästa vägen för segmentering har också klarlagts. De viktigaste egenskaperna hos bilddata i sig innefattar det som beskrivs här som kontrast, trängsel, sprödhet, och antalet olika former eller funktioner (t.ex. organeller, fibrer, membran). Subjektiva kriterier att överväga att inkludera det eftersträvade målet om segmentering (mätning / räkning, skeletonized representation av data / visning volymer i 3D-renderingar), morfologiska egenskaper inslag av intresse (linjär, avlång, nätverk, komplex, invecklad), densitet funktioner av intresse i förhållande till hela volymen (den del av de objekt som ärviktigt och behöver extraheras), och balansera avvägningar för spilla resurser till segmente trohet av den ursprungliga uppgifter och den minskande avkastning på investeringen resulterar i inkrementella förbättringar för väsentligt högre resursfördelning.
Området för bildsegmentering har betydligt mognat under de senaste åren, men det finns inga patentlösningar, utan algoritm eller ett program som kan göra allt. Data set storlekar har vuxit från hundratals megabyte för att rutinmässigt tiotals gigabyte, och de börjar nu att överträffa terabyte, vilket gör manuell segmente nära omöjligt. Således mer resurser måste satsas på de smarta och tidseffektiv funktion utvinning metoder som efterliknar det mänskliga beslutsfattandet. Dessa ansträngningar kommer att behöva kombineras med (1) geografiskt informationssystem (GIS) baserade semantiska hierarkiska databaser (liknande Google Earth), (2) uppgifter abstraktion tekniker (dvs övergårfrån en voxel till geometrisk / volymerepresentation) kompatibel med datorstödd konstruktion (CAD) program för att kraftigt minska mängden data och därmed möjliggör visning av större volymer 35, (3) simuleringstekniker, eftersom de ofta används i tekniska discipliner, samt (4) avancerad animation och filmskapande funktioner, inklusive fly-through animeringar (liknande det som utvecklats för spelindustrin).
Tydligt, effektiv funktion utvinning och segmentering ligger i hjärtat av den kommande revolutionen i cellulär högupplösta bildbehandling, och samtidigt bättre metoder alltid kommer att behövas, de principer som presenteras här, liksom exempel på vad strategi togs för olika datatyper , kommer att ge en del värdefull information för att fatta ett beslut om vilken lösning som är lämpligast.
The authors have nothing to disclose.
We would like to acknowledge and thank Tom Goddard at University of California San Francisco for his endless help with Chimera, Joel Mancuso and Chris Booth at Gatan, Inc. for their help with SBF-SEM data collection of bacteria dataset, Doug Wei at Zeiss, Inc. for his help with the FIB-SEM data collection of epithelial cell dataset, Kent McDonald at University of California Berkeley Electron Microscopy Lab for advice on sample preparation, TEM imaging and tomography, Roseann Csencsits at Lawrence Berkeley National Laboratory for her help taking the cryo-TEM image, Elena Bosneaga for cryo-sectioning of the plant dataset, Jocelyn Krey at Oregon Health and Science University for the dissection of utricle tissue, David Skinner at National Energy Research Scientific Computing Center (NERSC) and Jitendra Malik at University of California Berkeley for their advice in software infrastructure, and Pablo Arbelaez at University of California Berkeley for his codes contributions to the custom-tailored script presented in this article.
Research was supported by the U.S. Department of Energy, Office of Science under contract No. DE-AC02-05CH11231 [David Skinner], as well as U.S. National Institutes of Health (NIH) grant No. P01 GM051487 [M.A.] for the inner ear hair cell project and microscopy instrumentation use.
Material Name | Company | Comments | |
Amira | FEI Visualization Sciences Group | http://www.vsg3d.com/amira/overview | |
Chimera | UCSF | http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | |
Fiji/ImageJ | National Institute of Health | http://fiji.sc/Fiji, http://rsbweb.nih.gov/ij/ | |
IMOD | Boulder Laboratory for 3D Electron Microscopy of Cells | http://bio3d.colorado.edu/imod/ | |
Photoshop | Adobe | http://www.adobe.com/products/ photoshopfamily.html | |
MATLAB | MathWorks | http://www.mathworks.com/ | |
VLFeat | VLFeat | http://www.vlfeat.org/ |