In Situ Rilevamento di Autoreattivi CD4 cellule T nel cervello e nel cuore Utilizzo Maggiore di Istocompatibilità Dextramers classe Complex II
Summary
Il protocollo per rilevare le cellule autoreattive T CD4 nel cervello e nel cuore dalla colorazione diretto con complesso maggiore di istocompatibilità di classe II dextramers è stato descritto nella presente relazione. Per un'analisi completa, un metodo affidabile per enumerare le frequenze di cellule CD4 + T antigene-specifiche in situ è pensato anche.
Abstract
This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin proteolipid protein (PLP) 139-151-induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in SJL mice and cardiac myosin heavy chain-α (Myhc) 334-352-induced experimental autoimmune myocarditis (EAM) in A/J mice. Two sets of cocktails of dextramer reagents were used, where dextramers+ cells were analyzed by laser scanning confocal microscope (LSCM): EAE, IAs/PLP 139-151 dextramers (specific)/anti-CD4 and IAs/Theiler’s murine encephalomyelitis virus (TMEV) 70-86 dextramers (control)/anti-CD4; and EAM, IAk/Myhc 334-352 dextramers/anti-CD4 and IAk/bovine ribonuclease (RNase) 43-56 dextramers (control)/anti-CD4. LSCM analysis of brain sections obtained from EAE mice showed the presence of cells positive for CD4 and PLP 139-151 dextramers, but not TMEV 70-86 dextramers suggesting that the staining obtained with PLP 139-151 dextramers was specific. Likewise, heart sections prepared from EAM mice also revealed the presence of Myhc 334-352, but not RNase 43-56-dextramer+ cells as expected. Further, a comprehensive method has also been devised to quantitatively analyze the frequencies of antigen-specific CD4 T cells in the ‘Z’ serial images.
Introduction
L'uso del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) di classe II tetrameri per la rilevazione di cellule antigene-specifiche CD4 T è stata una sfida 1-7. Per migliorare la sensibilità di rilevazione di MHC classe II tetrameri, il team di ricerca ha creato tetrameri di prossima generazione, denominati "dextramers" 8. Dextramers contengono dorsali destrano in cui più frazioni streptavidina-fluoroforo sono coniugate, in modo che diversi peptidi-tethered, biotinilati monomeri MHC possono essere collegati ad una molecola destrano 9. Così, grandi aggregati di dextramers MHC che contengono diversi complessi MHC-peptide possono interagire con molteplici recettori delle cellule T (TCR).
Questo gruppo ha recentemente generato dextramers per varie auto-antigeni e ha dimostrato che la sensibilità di rilevazione di dextramers era di circa cinque volte più di tetrameri 8. I sistemi sperimentali includono encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) indotto con proteolipid proteina (PLP) 139-151 nei topi SJL; EAE indotta con mielina degli oligodendrociti glicoproteina (MOG) 35-55 in topi C57BL / 6; e miocardite autoimmune sperimentale (EAM) indotta con miosina cardiaca catena pesante-α (MyHC) 334-352 in A / J topi. Questo studio dimostra l'uso di PLP 139-151 – e MyHC 334-352 dextramers per rilevare le cellule antigene-specifiche CD4 T in situ con specificità sviluppando un protocollo di colorazione diretta, eliminando così la necessità di amplificare i segnali utilizzando anticorpi fluoroforo, un approccio comunemente impiegato con l'utilizzo di tetrameri. Inoltre, un metodo completo di valutare tessuti è anche stato studiato per enumerare affidabile le frequenze di cellule CD4 T antigene-specifiche in situ 10. Rilevamento di cellule T antigene-specifiche in situ permette delineazione di eventi provocati da stimoli antigenici specifici da quelle causate dall'attivazione astanti. Allo stesso modo, la tecnica in situ anche provides opportunità per monitorare la cinetica di infiltrazioni di cellule T antigene-specifiche negli organi bersaglio.
Protocol
Representative Results
Discussion
A differenza di tetrameri MHC di classe, l'uso di MHC classe II tetrameri per applicazioni di routine continua ad essere impegnativo, soprattutto per enumerare le frequenze precursori di cellule T CD4 autoreattivi bassa affinità, dovute in parte alla loro dipendenza di attivazione 6,15-17. Recentemente, questo problema è stato aggirato con la creazione della prossima generazione di tetrameri, chiamati "dextramers," ci permette di rilevare le cellule antigene-specifiche CD4 T per un certo numer…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla American Heart Association e dei Bambini Cardiomiopatia Foundation (SDG2462390204001), e il National Institutes of Health (HL114669). CM è un destinatario di una borsa di assegno di ricerca post-dottorato assegnato dalla Fondazione miocardite, NJ.
Materials
| CFA | Sigma Aldrich, St Louis, MO | 5881 | Store at 4οC |
| MTB H37Rv extract | Difco Laboratories, Detroit, MI | 231141 | Store at 4οC |
| PT | List Biologicals Laboratories, Campbell, CA | 181 | Store at 4οC |
| 1x PBS | Corning, Manassas, VA | 21-040-CV | Store at 4οC |
| Female A/J mice | Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME | 646 | |
| Female SJL/J mice | Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME | 686 | |
| Leur-lok sterile 1 ml syrringe | BD, Franklin Lakes, NJ | 309628 | |
| Leur-lok sterile 3 ml syrringe | BD, Franklin Lakes, NJ | 309657 | |
| Sterile needle, 18 G | BD, Franklin Lakes, NJ | 305195 | |
| Sterile needle, 27 1/2 G | BD, Franklin Lakes, NJ | 305109 | |
| 3-way stopcock | Smiths Medical ASD, Inc. Dublin, OH | MX5311L | |
| Kerlix gauze bandage rolls | Covidien, Mansfield, MA | 6720 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA | 34155 | |
| Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade | Promega corporation, Madison, WI | V2111 | |
| Immunopure normal goat serum | Thermo Scientific, Waltham, MA | 31873 | Store at -20 οC |
| Anti-mouse CD4 conjugated with PE dye | eBioscience, San Diego, CA | 12004185 | Store at 4οC |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | 19202 | Store at 4οC |
| Faramount Aqueous Mounting Medium | Dako, Carpinteria, CA | 10073021 | |
| Conical tube (15ml) | BD Biosciences, San Jose, CA | 352099 | |
| Conical tube (50 ml) | BD Biosciences, San Jose, CA | 352070 | |
| 24-well flat bottomed tissue culture plates | BD Biosciences, San Jose, CA | 356775 | |
| Water color #2 brushes | Charles Leonard, Inc. Hauppauge, NY | 73502 | |
| Plain Microscope slides, size: 3" x 1" x 1.2 mm | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 1255010 | |
| Premium Cover glass, 22 x 22-1 | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 12548B | |
| Disposable deep base mold histology cassettes | Laboratory prodcust, Rochester, NY | M-475-10 | |
| Loctite Super glue | Henkel Corporation, Westlake, OH | 1471879 | |
| Razor blades | Gillette SuperSilver | ||
| Myhc-a 334-352 (DSAFDVLSFTAEEKAGVYK) | Neopeptide, Cambridge, MA | Store at 4οC | |
| PLP 139-151 (HSLGKWLGHPDKF) | Neopeptide, Cambridge, MA | Store at 4οC | |
| MHC class II/IAs PLP 139-151 or TMEV 70-86 dextramers conjugated with APC dye | Store at 4οC | ||
| MHC class II/IAk Myhc 334-352 or or RNase 40-56 dextramers conjugated with APC dye | Store at 4οC | ||
| Dextran conjugated SA-APC | Immundex, Copenhagen, Demark | Store at 4οC | |
| Sterile surgical scissors and forceps | INOX tool Corporation | ||
| Micro oven | GE Healthcare, Pittsuburgh, PA | ||
| Leica VT 1200 Vibratome | Leica Microsystems, Inc. Buffalo Grove, IL | ||
| Olympus BX 60 Laser scanning confocal microscope | Olympus America, Inc. Center Valley, PA | ||
| Nikon A1-Eclipse 90i confocal microscope | Nikon Inc. Melville, NY |
References
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