A medição da taxa metabólica em<em> Drosophila</em> Usando respirometria
Summary
Distúrbios metabólicos estão entre uma das doenças mais comuns em humanos. O modelo de organismo geneticamente tratável D. melanogaster pode ser utilizado para identificar novos genes que regulam o metabolismo. Este artigo descreve um método relativamente simples, que permite estudar a taxa metabólica em moscas, medindo a sua produção de CO2.
Abstract
Distúrbios metabólicos são um problema freqüente que afeta a saúde humana. Portanto, a compreensão dos mecanismos que regulam o metabolismo é uma tarefa científica crucial. Muitos genes que causam doenças nos seres humanos têm um homólogo mosca, tornando Drosophila um bom modelo para estudar vias de sinalização envolvidas no desenvolvimento de doenças diferentes. Além disso, a rastreabilidade de Drosophila simplifica telas genéticos para ajudar a identificar novos alvos terapêuticos que podem regular o metabolismo. A fim de realizar tal tela um método simples e rápido para identificar alterações no estado metabólico de moscas é necessário. Em geral, a produção de dióxido de carbono é um bom indicador de oxidação de substrato e gasto de energia fornecendo informações sobre o estado metabólico. Neste protocolo, apresentamos um método simples de medir CO 2 saída de moscas. Esta técnica pode potencialmente auxiliar na identificação de perturbações genéticas que afectam a taxa metabólica.
Introduction
O ciclo de Krebs bioquímica gera ATP por meio da oxidação do derivado de acetato de hidratos de carbono, gorduras e proteínas produtoras de CO 2. Em Drosophila, O 2 entrada é diretamente correlacionado com CO 2 de saída e reflete o nível de metabolismo 1. Assim, a medição de CO 2 saída de sucesso tem sido utilizado em estudos relacionados ao envelhecimento e metabolismo 2-5. Aqui nosso laboratório tem modificado montagens experimentais previamente elaborados, permitindo a medição da produção de CO 2 em até dezoito amostras sem necessidade de qualquer equipamento especializado. Outros e nós já usou esse método para mostrar as diferenças nas taxas metabólicas em moscas que são deficientes na proteína associada muscular distrofia, Dystroglycan (GD) 6-8.
O 2 usado para o metabolismo oxidativo é convertido em CO2, o qual é expelido como resíduos respiratória. A construçãoção de respirômetros feito à mão é descrito que permite a determinação da taxa de O 2 consumido. As moscas são colocadas em um recipiente vedado com uma substância que absorve o CO2 expelido, eliminando-o de forma eficiente a partir da fase gasosa. A variação do volume do gás (diminuição da pressão) é medido por deslocamento de fluido num capilar de vidro ligado ao respirómetro fechada.
A principal vantagem desta técnica sobre os outros é o custo. Estudos anteriores já haviam medido produção de CO 2 por Drosophila usando analisadores de gás e sistemas de respirometria tecnicamente avançados 1,9. Apesar do equipamento mais complexo, a sensibilidade do método aqui descrito é semelhante aos valores relatados (Tabela 1). Além disso, vários outros grupos usaram variações desta técnica para determinar as taxas metabólicas relativas em Drosophila 4-6. Por isso, este ensaio pode ser usado para gerar reliable, dados reprodutíveis relevantes ao metabolismo Drosophila sem a aquisição de equipamento especializado, que pode ser configurado em qualquer laboratório e pode ser usado para fins educacionais.
Em geral, as técnicas aceites para determinar o metabolismo de um organismo é medir a produção de CO 2, O 2 consumido, ou ambos 3,4,9. Porém, pode ser assumido que um equivalente de O 2 gera um equivalente de CO 2, a relação precisa de CO 2 gerado é dependente do substrato metabólico utilizado 10. Assim, para determinar com precisão a taxa de metabolismo em unidades de energia, é necessário medir ambos O 2 consumido e do CO 2 produzido. Devido a isto, o método descrito aqui é especificamente relevante para comparar diferenças na produção de CO 2 entre os animais e não os valores absolutos. Nossa técnica integra vários animais CO 2 da produção durante um período de time (1-2 horas) e, portanto, retorna uma média da actividade dos animais. Se não há razão para acreditar que os animais experimentais são menos ativas do que os animais de controle a medida pode refletir diferentes níveis de atividade e metabolismo não necessariamente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste protocolo, descrevemos um método barato e confiável para medir a produção de CO 2 em moscas. Descobrimos que esta experiência é fácil, rápido para conduzir e gera dados reprodutível que está de acordo com outros estudos 1, 6, 9. O protocolo descrito aqui pode ser facilmente modificado para se adequar orçamento e materiais disponíveis de qualquer laboratório. A construção de cada um respirómetro indivíduo pode ser adaptado, enquanto mantém a câmara hermética. No entanto, o …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer a Sociedade Max-Planck para financiar nossa pesquisa.
Materials
| BlauBrand IntraMark 50µl micropipettes | VWR | 612-1413 | |
| Soda Lime | Wako | CDN6847 | |
| Eosine | Sigma | 031M4359 | Any dye that can create visible colorization of liquid can be used |
| Thin Layer Chromatorgaphy (TLC) Developing Chamber | VWR | 21432-761 | Any transparent glass chamber that can be closed with the lid |
| Anesthetizer, Lull-A-Fly Kit | Flinn | FB1438 | |
| Power Gel Glue | Pritt | ||
| 1 ml pipett tips | Any | ||
| Foam | Any | ||
| Plaesticine Putty | Any | ||
| Scalpel | Any | ||
| Twezzers | Any |
References
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