Måling af stofskifte i<em> Drosophila</em> Hjælp respirometri

Summary

Stofskiftesygdomme er blandt en af ​​de mest almindelige sygdomme hos mennesker. Den genetisk medgørlig model organisme D. melanogaster kan anvendes til at identificere hidtil ukendte gener, der regulerer stofskiftet. Dette papir beskriver en forholdsvis enkel fremgangsmåde, som gør det muligt at studere stofskiftet i fluer ved at måle deres CO _{2-produktion.}

Abstract

Stofskiftesygdomme er et hyppigt problem, der påvirker menneskers sundhed. Derfor forstå de mekanismer, der regulerer stofskiftet er en afgørende videnskabelig opgave. Mange sygdomsfremkaldende gener i mennesker har en flue homolog, at Drosophila en god model til at studere signalveje, der er involveret i udviklingen af forskellige lidelser. Derudover spores Drosophila forenkler genetiske skærme til at hjælpe med at identificere nye terapeutiske mål, der kan regulere stofskiftet. For at udføre en sådan skærm er nødvendigt med en enkel og hurtig metode til at identificere ændringer i metaboliske tilstand af fluer. I almindelighed kuldioxid produktion er en god indikator for substratoxidering og energiomsætning give oplysninger om metaboliske tilstand. I denne protokol indfører vi en enkel metode til at måle CO _2-output fra fluer. Denne teknik kan potentielt hjælpe med identifikationen af ​​genetiske forstyrrelser, der påvirker stofskiftet.

Introduction

Den biokemiske Krebs cyklus genererer ATP ved oxidering af acetat afledt fra kulhydrater, fedtstoffer og proteiner, der frembringer CO _2. I Drosophila, O _2-indgangen er direkte korreleret med CO _2-produktion og afspejler niveauet af stofskiftet ^1. Således har måling af CO _2-udgang med succes været anvendt i undersøgelser i forbindelse med aldring og stofskifte ^2-5. Her vores laboratorium har ændret tidligere designet forsøgsopstillinger, så måling af CO _{2-produktionen} i op til atten prøver uden at kræve nogen specialiseret udstyr. Andre, og vi har tidligere brugt denne metode til at vise forskelle i stofskifte i fluer, der er mangelfuld i muskelsvind protein, dystroglycan (DG) ^6-8.

O ₂ anvendes til oxidativ metabolisme omdannes til CO _2, der er udvist som respiratorisk affald. Opførelsention af håndlavede respirometers beskrives som giver mulighed for bestemmelse af hastigheden af O ₂ forbruges. Fluerne anbringes i en forseglet beholder med et stof, der absorberer udvises CO _2, effektivt fjerne det fra gasfasen. Ændringen i gasvolumen (reduceret tryk) måles ved forskydning af væske i et glaskapillar fastgjort til den lukkede respirometer.

Den væsentligste fordel ved denne teknik i forhold til andre er omkostningerne. Tidligere undersøgelser har målt CO ₂ produktion af Drosophila hjælp gas analysatorer og teknisk avancerede respirometri systemer ^1,9. Trods en mere kompliceret udstyr, følsomheden af den her beskrevne fremgangsmåde svarer til rapporterede værdier (tabel 1). Derudover har en række andre grupper anvendes variationer af denne teknik til at bestemme relative stofskifte i Drosophila ^4-6. Derfor kan dette assay anvendes til at frembringe reliable, reproducerbare relevante data for Drosophila stofskifte uden indkøb af specialudstyr, som kan være setup i enhver laboratorium og kan bruges til uddannelsesmæssige formål.

I almindelighed er de anerkendte teknikker til at bestemme metabolismen af en organisme er at måle produktionen af CO _2, O ₂ forbruges, eller begge dele ^3,4,9. Dog kan det antages, at en ækvivalent af O ₂ genererer en ækvivalent af CO _2, den nøjagtige andel af CO ₂ genereres, er afhængig af den metaboliske substrat udnyttet ^10.. Således, at nøjagtigt at bestemme stofskiftet i energienheder er det nødvendigt at måle både O ₂ forbruges og CO ₂ produceres. På grund af dette, den her beskrevne fremgangsmåde er særlig relevant for at sammenligne forskelle i CO _2-produktion mellem dyr og ikke den absolutte værdi. Vores teknik integrerer flere dyr CO ₂ produktion over en periode på time (1-2 timer), og derfor returnerer et gennemsnit af dyrenes aktivitet. Hvis der er grund til at tro, at forsøgsdyrene er mindre aktive end kontrol dyrene målingen kunne afspejle forskellige niveauer af aktivitet, og ikke nødvendigvis stofskifte.

Protocol

1. Fremstilling af Respirometers Skær 1.000 ul pipettespids med et barberblad for at tillade indsættelsen af ​​50 ul kapillar mikropipette, forsøge at få pipettespidsen så lige som muligt. Læg et stykke skum ind i pipetten, og skub den ned i pipettespidsen. Tilsæt en lille mængde CO 2 absorberende og indeholder det med et andet stykke skum. Påfør lim på det sted, hvor mikropipetten indsættes i pipettespidsen. Lad respirometerkolben natten over…

Representative Results

For at vise, at metoden er følsom vi målte CO 2-produktion fra vildtype (Oregon R) mandlige flyver på 18, 25 og 29 ° C og fluer mutant til GD. Fluer blev rejst ved 25 ° C og derefter flyttet til den eksperimentelle temperatur i 5 dage før måling. Som forventet for dette ectothermic art, mængde CO 2 fremstillet øges med temperatur (figur 2). Vi har tidligere vist, at en sukker fri kost nedsætter stofskiftet af både vildtype og Dg mutant fluer <s…

Discussion

I denne protokol, beskriver vi en billig og pålidelig metode til måling af CO ₂ produktion i fluer. Vi fandt, at dette eksperiment er nem, hurtig at gennemføre og genererer reproducerbare data, der er i overensstemmelse med andre undersøgelser ^{1, 6, 9.} Protokollen beskrevet her kan let ændres til at passe enhver laboratoriets budget og tilgængelige materialer. Opførelsen af ​​enkelte respirometer kan tilpasses, så længe kammeret bliver utæt. Men jo længere, tyndere mikropipetter tilb…

Materials

BlauBrand IntraMark 50µl micropipettes	VWR	612-1413
Soda Lime	Wako	CDN6847
Eosine	Sigma	031M4359	Any dye that can create visible colorization of liquid can be used
Thin Layer Chromatorgaphy (TLC) Developing Chamber	VWR	21432-761	Any transparent glass chamber that can be closed with the lid
Anesthetizer, Lull-A-Fly Kit	Flinn	FB1438
Power Gel Glue	Pritt
1 ml pipett tips	Any
Foam	Any
Plaesticine Putty	Any
Scalpel	Any
Twezzers	Any