Måling av Metabolic Rate i<em> Drosophila</em> Hjelp respirometri

Summary

Metabolske forstyrrelser er blant en av de mest vanlige sykdommer hos mennesker. Den genetisk medgjørlig modell organisme D. melanogaster kan anvendes for å identifisere nye gener som regulerer forbrenningen. Dette notatet beskriver en relativt enkel metode som gjør det mulig å studere metabolic rate i fluer ved å måle deres CO _{2-produksjon.}

Abstract

Stoffskiftesykdommer er et hyppig problem som berører menneskers helse. Derfor forstå mekanismene som regulerer stoffskiftet er en viktig vitenskapelig oppgave. Mange sykdomsfremkallende gener hos mennesker har en flue homologue, gjør Drosophila en god modell for å studere signalveier er involvert i utviklingen av ulike lidelser. I tillegg er tractability av Drosophila forenkler genetiske skjermer for å hjelpe til med å identifisere nye terapeutiske mål som kan regulere stoffskiftet. For å kunne utføre en slik skjerm er nødvendig for en enkel og rask metode for å identifisere endringer i den metabolske tilstand av fluer. Generelt, er karbondioksid produksjons en god indikator på substratet oksydasjon og energiforbruk gi informasjon om metabolsk tilstand. I denne protokollen innfører vi en enkel metode for å måle CO ₂ utgang fra fluer. Denne teknikken kan eventuelt hjelpe til med identifisering av genetiske forstyrrelser som påvirker metabolismen.

Introduction

Den biokjemiske Krebs syklus produserer ATP via oksidasjon av acetat avledet fra karbohydrater, fett og proteiner som produserer _CO2. I Drosophila, O _2-inngang er direkte korrelert med CO _2-utgang og reflekterer nivået av stoffskiftet ^en. Således har måling av CO _2-utgang med hell blitt brukt i studier relatert til aldring og metabolisme ^2-5. Her vårt laboratorium har endret tidligere designet forsøksoppsett, slik at måling av CO _2-produksjon i opp til atten prøver uten å kreve noen spesialisert utstyr. Andre og vi har tidligere brukt denne metoden for å vise forskjeller i stoffskifte i fluer som er mangelfull i muskeldystrofi assosiert protein, dystroglycan (Dg) ^6-8.

O ₂ brukes for oksidativ metabolisme omdannes til CO _2, som er utvist som luft avfall. Bygsjon av håndlagede respirometers er beskrevet som gjør det mulig for bestemmelse av hastigheten av O ₂ forbrukes. Fluer er plassert i en forseglet beholder med en substans som absorberer utvist CO _2, effektivt eliminere den fra den gassformige fase. Endringen i gassvolum (redusert trykk) er målt ved fortrengning av fluidum i et glass kapillær festet til den lukkede respirometer.

Den største fordelen med denne teknikken over andre er kostnaden. Tidligere studier har målt CO ₂ produksjon av Drosophila hjelp gass analysatorer og teknisk avanserte respirometri systemer ^1,9. Til tross for den mer komplisert utstyr, er sensitiviteten av metoden beskrevet her lik rapporterte verdier (tabell 1). I tillegg har flere andre grupper brukte varianter av denne teknikken til å bestemme relative stoffskifte i Drosophila ^4-6. Derfor kan denne analysen anvendes for å generere reliable, reproduserbare data som er relevante for Drosophila metabolisme uten kjøp av spesialisert utstyr som kan settes opp på noen lab og kan brukes til pedagogiske formål.

Generelt aksepterte teknikker for å bestemme forbrenningen av en organisme, er å måle _CO2 produsert, O ₂ forbrukes, eller begge deler ^3,4,9. Skjønt, kan det antas at en ekvivalent av O ₂ genererer en ekvivalent av CO _2, den nøyaktige forhold mellom CO ₂ genereres er avhengig av metabolsk substrat benyttet ^10. Derfor, for å nøyaktig bestemme den metabolske hastighet i energienheter er det nødvendig å måle både O ₂ forbrukes og _CO2 produsert. På grunn av dette er fremgangsmåten som er beskrevet her er spesielt relevant for å sammenligne forskjeller i CO _2-produksjon mellom dyr og ikke den absolutte verdi. Vår teknikk integrerer flere dyr CO ₂ produksjon i en periode på time (1-2 timer) og således returnerer et gjennomsnitt på dyrenes aktivitet. Dersom det er grunn til å tro at de eksperimentelle dyr er mindre aktiv enn kontrolldyrene målingen kan reflektere forskjellige nivåer av aktivitet, og ikke nødvendigvis metabolisme.

Protocol

En. Utarbeidelse av Respirometers Kutt 1000 mL pipette spissen med et barberblad for å tillate innføring av 50 mL kapillær micropipette, prøve å få pipettespissen så rett som mulig. Legg et stykke skum inn i pipetten og trykk den ned i pipettespissen. Tilsett en liten mengde CO2 absorbent og inneholder den ved en andre del av skum. Påfør lim på stedet der micropipette settes inn i pipettespissen. La respirometer over natten for å la limet tørker. …

Representative Results

For å vise at fremgangsmåten er følsom vi målte CO 2-produksjon fra villtype (Oregon R) hann flyr ved 18, 25, og 29 ° C og fluer mutant for Dg. Fluer ble hevet ved 25 ° C og deretter skiftet til den eksperimentelle temperatur i 5 dager før måling. Som forventet for denne ectothermic art, produserte mengden av CO2 øker med temperaturen (figur 2). Vi har i det siste vist at en diett sukkerfri reduserer metabolic rate av både villtype og Dg mutant …

Discussion

I denne protokollen beskriver vi en billig og pålitelig metode for å måle _{CO2-produksjon} i fluer. Vi fant ut at dette eksperimentet er enkel, rask å gjennomføre og genererer reproduserbare data som er i overensstemmelse med andre studier ^{1, 6, 9.} Protokollen skissert her kan enkelt endres til å passe alle laboratorie budsjett og tilgjengelige materialer. Konstruksjonen av hvert enkelt respirometer kan tilpasses så lenge kammeret forblir lufttett. Men jo lenger, tynnere mikropipetter tilby me…

Materials

BlauBrand IntraMark 50µl micropipettes	VWR	612-1413
Soda Lime	Wako	CDN6847
Eosine	Sigma	031M4359	Any dye that can create visible colorization of liquid can be used
Thin Layer Chromatorgaphy (TLC) Developing Chamber	VWR	21432-761	Any transparent glass chamber that can be closed with the lid
Anesthetizer, Lull-A-Fly Kit	Flinn	FB1438
Power Gel Glue	Pritt
1 ml pipett tips	Any
Foam	Any
Plaesticine Putty	Any
Scalpel	Any
Twezzers	Any