In Vivo 4-Dimensional Sporing av Hematopoietiske Stem og stamceller i Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Summary

Naturen av samspillet mellom blodkreft stamceller og stamceller (HSPCs) og beinmargs nisjer er dårlig forstått. Tilpassede hardware modifikasjoner og en multi-trinn oppkjøpet protokollen tillater bruk av to-foton og konfokalmikroskopi til bilde ex vivo merket HSPCs omplassert innen benmargs områder, sporing samhandling og bevegelse.

Abstract

Gjennom en hårfin balanse mellom quiescence og spredning, selvfornyelse og produksjon av differensiert avkom, blodkreft stamceller (HSCs) opprettholde omsetningen til alle modne blodceller linjene. Samordningen av de komplekse signaler som fører til bestemte HSC skjebner er avhengig av samspillet mellom HSCs og intrikate mikromiljøet i benmargen, som fortsatt er dårlig forstått ^[1-2].

Vi beskriver hvordan ved å kombinere en nyutviklet prøveholder for stabil posisjonering dyr med flertrinns konfokal og to-foton in vivo bildeteknikker, er det mulig å oppnå høy oppløsning inneholdende 3D-stabler HSPCs og deres omkring nisjer og for å overvåke dem over tid gjennom multi-point time-lapse imaging. Høydefinisjons bilde kan oppdage ex vivo merket blodkreft stamceller og stamceller (HSPCs) bosatt i benmargen. Videre, multi-point time-lapse 3D avbildning, obtained med raskere anskaffelses innstillinger, gir nøyaktig informasjon om HSPC bevegelse og de gjensidige interaksjoner mellom HSPCs og Stroma celler.

Sporing av HSPCs i forhold til GFP osteoblastiske positive celler er vist som et eksempel på anvendelse av denne fremgangsmåte. Denne teknikken kan benyttes til å spore enhver hensiktsmessig merket hematopoietisk eller stromal celler av interesse innenfor musa calvarium benmargsrommet.

Introduction

Til tross for stamcelle nisjer å ha blitt anerkjent i flere tiår ^tre og godt preget i mange vev som luktelappen, muskelfiber, hårsekken kul eller CNS subventricular sone ^4-7, samspillet mellom blodkreft stamceller (HSCS) og mikromiljøet i benmargen ( BM) er fremdeles dårlig forstått på grunn av vanskeligheten med å direkte observere enkeltceller gjennom benet samt ekstremt flytende natur av selve vevet. Det har vist seg, gjennom en rekke funksjonelle studier basert på ablating eller overekspresjon av spesifikke gener i enten HSCs eller stromale celler i mikromiljøet i seg selv, som en intrikat nettverk av forskjellige celletyper og-regulerende signaler er ansvarlig for å regulere en delikat balanse mellom quiescence , spredning, utvidelse og differensiering av HSCs ^1-2. Crosstalk mellom HSCs og sine nisjer kan forstås i dybden bare gjennom direkte observasjon. Dette er achievable takket være utviklingen av avanserte bildebehandlings protokoller, som kombinerer den tilgjengelige teknologien ikke bare i form av mikroskopi, men også av prøveholder løsninger og av anskaffelses programvare.

Enkelt celle oppløsning direkte avbildning av transplanterte blodkreft stamceller og stamceller (HSPCs) i BM rommet av muse calvaria bein viste at engrafting HSPCs lokalisere seg i nærheten av SDF-1 og VCAM-1-positive fartøy ^8-9 og at mer umodne celler finnes innenfor 15 – 20 mikron fra GFP-positive osteoblastiske celler (Col2.3-GFP transgen muselinje, der osteoblastbegrenset kollagen 1α promoter driver GFP uttrykk) mens deres avkom er mer distal ^10. Lignende observasjoner ble innhentet fra dissekert og brukket femur bein ¹¹ og fra tynnet tibeal bein ^12. Avbildning av calvarial benmarg fortsatt den minst invasiv tilnærming for å oppnå direkte visualisering av HSPCs innen thEIR innfødte mikromiljøet.

Med noen live prøven bildebehandling det er en iboende behov for å holde prøven så stille som mulig for å unngå unødvendige gjenstander på grunn av prøven bevegelse. Breathing forårsaker oscillasjon bevegelser av musen hodet, som må unngås når bildebehandling calvarial benmarg. Konvensjonelle stereotaktisk holdere, som brukes for eksempel for avbildning av hjernen og elektrofysiologi, er ikke egnet for calvarium bildebehandling fordi de hindrer frontpartiet bein. Start fra en mus holderen brukes for å minimalisere ubehag i løpet av levende bilde-og elektrofysiologiske studier ^13, ble en 2-komponent holderen utviklet, med et lite stykke festet til hodet av musen for å skape en avbildning vindu som er koblet til et større arm sikrer stødig grep med en tung basisplate som sikrer godt inn i mikroskopet stadium. Sikring hodet stykke til skallen på musen tillater fri puste samtidig immobilisere hodet på plass og tilstrekkelig eliminere movements grunn puste. A 'lås-og nøkkel "mekanisme som forbinder hodestykket til holderlegemet gjør at størrelsen av vinduet å bli minimalisert, så vel som økt nøyaktighet i posisjoneringen, og derfor forenkle operasjonen, og tilpasning av bunnplaten inn i scenen gir mulighet for nøyaktig innretting på mikroskopet. For å nøyaktig overvåke bevegelige celler, ble en flerpunkts tidsforløp protokoll utformet til å tillate sporing av celler over tid med 5 minutters intervaller mellom tidspunktene. Her, gjorde merket HSCs som injiseres i col2.3GFP osteoblasitc reporter mus ^10,14 og avbildes ca 20 timer senere. Musen holderen som ble utviklet, og de bildedannende innstillinger som er nødvendige for å utføre rask flerpunkts time-lapse avbildning av de samme områdene over en periode på flere timer, er beskrevet i detalj.

Protocol

Alle prosedyrer som involverer bruk av dyr er gjennomført i henhold til lokal lovgivning. Vårt arbeid er godkjent av den britiske Home Office samt Imperial College etisk gjennomgang panel. De tillatte prosedyrene er beskrevet i prosjektdokumentasjonen lisens og følge retningslinjer som sikrer velferd for dyret til enhver tid. Sørg for å overholde bestemmelsene om dyrs eksperimentering av landet der arbeidet utføres. 1. Merking og injeksjon av HSPCs: Høste celler som beskrevet av Lo Celso 14-15. Forbered cellene ved en konsentrasjon på 10 6 celler / ml i PBS. MERK: Bruk en hemocytometer eller informasjonen som gis av cellen sorter å telle cellene; antall celler som skal merkes, og injiseres varierer avhengig av celletype (stain for eksempel 10000 – 20000 HSCs, 100.000 – 300.000 HPCS); hvis arbeider med mindre enn 10 5 celler, resuspender i 100 ul av PBS; er det viktig å ha cellene i PBS uten serum, som serum hemmer farging. Legg VISSTe til cellesuspensjonen til en endelig konsentrasjon på 5 uM og vortex suspensjonen umiddelbart for å sikre at fargestoffet ikke utfelles av oppløsningen, og mislykkes i å merke celler. Inkuber i 10 min ved 37 ° C og deretter vaskes ved rotasjon ved 500 xg i 5 minutter, dekantering av væsken, og resuspendering av pelleten i et passende volum for IV-injeksjon (~ 100 – 150 ul) Resuspender cellene i 200 pl PBS og samles opp i en insulinsprøyte. MERK: en insulinsprøyte anbefales fremfor en konvensjonell sprøyte, fordi det ikke har noen nål dødrom, og derfor gjør det mulig å administrere hele cellesuspensjonen til mus. Injisere cellene inn i en dødelig bestrålte mus via halevenen injeksjon. MERK: Bestråling har kjent, betydelig påvirkning på mikromiljøet i benmargen (både blodkreft og stromal komponenter), som utvikler seg over timeg. Det er derfor svært viktig å opprettholde konsistente tidspunktet for bestråling, celleinjeksjon (4-24 timer fra bestråling for beste innpodingen) og avbildning. Her bestråling utføres 6. time før injeksjon og avbilding blir utført 20 timer etter injeksjon. Plasser mus i et varmt kammer (37 ° C) til halevenen vises vasodilated. Flytt musen inn i rainer og skyv nålen inn i halevenen. Injisere cellene inn i venen – ingen motstand til injeksjon bør oppstått. La muse O / N for å tillate cellene å migrere til de benmarg mellomrom. 2. Klargjøring av mus for Imaging Autoklaver i ett par av fine pinsetter og ett par av fine sakser samt et hodestykke før anvendelse og oppbevares på et sterilt miljø. Sminke bedøvelse så fersk som mulig, (0,38 ml Ketamin + 0,25 ml Medetomidin + 4,47 ml vann). MERK: othennes godkjente bedøvelsesmidler, inkludert isofluran og andre injiserbare, vil være effektive også. Den cocktail beskrevet skal administreres intraperitonealt på 0,1 ml per 10 g kroppsvekt, med topp-ups av 30-50 pl administrert hver 45 min til 1 time. Slå på to-foton laser om nødvendig deretter starte mikroskopet og programvare, kalibrering av scenen når du blir bedt. Slå på lasere og tillate dem å varme opp og stabilisere mens du forbereder musen for bildebehandling. Anesthetize musen bruker det tilberedte anestesiblanding (trinn 2.2) for den valgte bedøvelse via intraperitoneal injeksjon. Overvåk utbruddet av dyp anestesi via pedal refleks nå og med jevne mellomrom gjennom hele protokollen. MERK: Musen må overvåkes nøye gjennom hele prosedyren, og hvis anestesi ser ut til å lysne (typisk etter 45 – 60 min) og deretter administrere en topp-up dose (som beskrevet i 2.2). Forvent noe variasjon mellom mus i ulike aldre og kjønn. Det er importertig å diskutere anestesi protokollen med din lokale veterinær offiser for å sikre tilstrekkelige forholdsregler er tatt for å sikre musen velferd. Vattpinne toppen av hodebunnen med 70% etanol på et papir, og sikrer ikke å få noen etanol i øynene av musen. Ved hjelp av sterile pinsetter og sakser, fjern forsiktig det sentrale parti av hodebunnen for å eksponere calvarium området som skal avbildes: lage et lite snitt på baksiden av hodet mellom ørene ved å løfte huden opp med pinsett. Ved å holde i huden opp, skyver saksen under huden og forsiktig kuttet langs utsiden av det ønskede avbildningsområdet. Tørk den eksponerte bein med steril bomullspinne fuktet med sterilt PBS for å holde det fuktig. Fest metallstykket til skallen av musen klar for bildebehandling. Bland en tilstrekkelig mengde av dental sement i en veie båt til det blir et lim og raskt anvendelse på bunnflaten av hodestykket som vil feste til skull. Før sement sett, plasserer hodestykket på hodeskallen av musen, og pass på så du ikke får dental sement på bildeområdet, og deretter vente på det å stille inn. Påfør en liten mengde INTRASITE Hydrogel som holder skallen fuktig. Fest headpiece til innehaveren og fest på plass ved hjelp av skruen, slik at sporene passer innenfor innehaveren hakk. Fjern hydrogel fra skallen med sterile bomullspinner og ren med sterilt PBS før du overfører til mikroskopet. Sett holderen inn i mikroskopet scenen, plasserer varmematten under musen, sett rektal termometer probe og sikre alt på plass på scenen med teip. Plasser en liten dråpe av oftalmologiske salve på øynene av musen for å sikre at de ikke tørke ut mens under bedøvelse. MERK: Musen må ikke forlates uten tilsyn når som helst i løpet av bildeprosessen mens under anestesi. <p cl. ass = "jove_title"> 3 in vivo avbildning: Høy oppløsning Stabler og Time-lapse Acquisition Fokus på skallen via øyet stykker. Fyll bildevinduet med renset, sterilt vann og bruke en vann dipping objektiv, senke den slik at den berører vanndråpe. Fokus på toppen av skallen ved hjelp av mikroskop okularene, ved hjelp av en ekstern lyskilde som lys-kilde. Plasser bildeområdet på den sentrale sutur og bevege seg mot baksiden av hodet for å finne den koronale sutur som en startposisjon. Sett i mikroskop opp for å tillate effektiv eksitasjon og deteksjon av de aktuelle fluoroforer som er angitt i tabell eksitasjon og emisjon. MERK: mens en Leica SP5 oppreist confocal med en konvensjonell galvanoskannehodet kjører LAS-AF programvareplattform er brukt her, kan prosedyren være lett replikert i andre mikroskop / programvareplattformer. Objektivet er brukt her er Leica HCX IRAPO L 25x W / 0,95 NA bUT tilsvarende objektiver fra andre produsenter er tilgjengelig med passende forstørrelse og høy NA Plasser programvare inn i en modus for å fange opp både XY bilder samt en 3D Z-stack og sette bildehastigheten til 400 Hz og oppløsningen til 512 x 512 piksler. MERK: oppsett og hardware her resultere i et synsfelt på 620 mikrometer og dette kan variere på andre plattformer. Sett programvaren, slik at flere kanaler / spor er i stand til å bli tatt, samt å sikre at innsamlingsmetoden er satt til å endre innstillinger mellom stabler hvis mulig, eller mellom rammer i det minste. Sett opp tre uavhengige opptaksinnstillinger, slå av laserbelysning på slutten av oppkjøpet av hver bunke. MERK: tre kanaler vil være nødvendig for denne prosedyren for å redusere crosstalk mellom kanalene. Oppsett innstillingene for første sekvensiell skanning for to foton SHG bein signal (840 nm eksitasjon, 400-440 nm utslipp); åpne lukkeren for MP laser og sikre MP gain og offset er riktig oppsett, er laser makt 12,5 til 25% og laseren er slått på. Velg en passende PMT som eneste detektor og endre fargen til hvit. Merk: NDD detektorer med passende filtre skal brukes for deteksjon benet når det er tilgjengelig for å oppnå en lysere, dypere signal. Gjenta kanaloppsettet prosedyre som brukes for GFP kanal for en kombinert autofluorescence (543 nm eksitasjon, 560 – 600nm utslipp) og gjorde (633 nm eksitasjon, 650-720 nm utslipp) under andre innstillinger skanne, utnytte to aktuelle PMTs. Endre kanal farge til grønt for autofluorescence og rødt for gjorde. Merk: Bruk av grønt som auto-fluorescens-kanalen gjør enklere påvisning av DID positive celler når de to kanalene blir overlappet – autofluorescent celler vises som gul / orange grunn til å være i begge kanaler mens VISSTe celler vises bare som rød siden de vises bare i VISSTe kanal. Den auto-fluorescens kanalbrukes kun for denne sammenligningen, og er ikke brukt i noen endelige analysen, men hvis brukeren ønsker å, kan dette endres til en annen farge for visning formål å unngå forveksling med GFP kanalen. Endelig oppsett den tredje og endelige skanningen for GFP (488 nm eksitasjon, 500-530 nm utslipp); sørge for at lukkeren er åpen hvis nødvendig, og deretter sette lasereffekten av 488 nm laser linje til rundt 15% eller et passende nivå for laser som brukes, velges en passende PMT som den eneste aktive detektor og endre Pseudo til grønt. Aktivere en "live" bildemodus for å starte en forhåndsskanning av den valgte kanalen og justere detektor Gain og Offset for optimal eksponering. Gjenta dette for hver skanning i den sekvensielle vinduet. Lagre innstillingene for disse flerkanals skanner for enkel gjenbruk. MERK: Dette lar brukeren laste inn innstillingene i senere økter. Aktiver flere posisjoner fangst, referert til som "Mark etnd Finn "i demonstrert programvare, og tilbakestille koordinere poeng. Skanne bein bildebehandling området, fra skjæringspunktet mellom det sentrale og koronale sutur, skanne dybden av beinmarg området ved hjelp av både autofluorescence (pseudo farget grønn) og gjorde (pseudo-farget rødt) med en sammensatt visning. MERK: autofluorescent celler vil være tilstede i begge kanaler og vises orange / gul i det sammensatte bildet, mens ViSStE merkede celler vil vises som red-bare celler i det sammensatte bildet. Når en celle blir oppdaget, markere dette som en ny koordinere posisjon (x, y og z) i 'Mark og Finn' verktøyet ved å klikke på "Legg til ny posisjon ikonet på venstre side av" Mark og Finn "vindu . Når den nåværende synsfeltet har blitt undersøkt, flytte scenen avstand på ett synsfelt enten venstre / høyre / ned / opp. Gjenta denne prosessen for hver synsfelt, mens du gradvis rundt hele bildevinduet området til venstre for the sentral sutur, beveger seg mot nesen av musen. Når den sentrale sutur bifurcation er i sikte, bevege seg til høyre side av sutur og gjenta prosedyren skanner venstre side i motsatt retning (dvs. mot koronale sutur). Marker koordinatene til eventuelle nye celler av interesse ved hjelp av "Mark og Finn" verktøy. Når skanning av bildevinduet er ferdig, bruker du 'Mark og Finn' verktøy for å gjennomgå poeng (velg ønsket punkt og vurdere hvert punkt individuelt). Sett toppen og bunnen av en Z-stack rundt hver celle for hver posisjon, (mange programvareplattformer vil tillate deg å utføre selvstendige z-stabler for hver posisjon, noe som reduserer fange tomrom). For hvert punkt, fokus opp og ned og sette øvre og nedre Z posisjoner for 3D z-stack fangst og oppdatere den enkelte punkt i 'Mark og Finn'. Sett Z-Stack intervallet til 5 pm og gjennomsnitt for hver sekvensiell skanning kanal til riktig kvalitet: Linje or Frame gjennomsnittet. MERK: Øke antall skanninger til gjennomsnittlig øker lengden på kjøpet tid. Få en høy kvalitetstegn stabelen for hvert punkt av interesse ved å starte hele skanningen (ofte referert til som "Start" heller enn "Capture"). Merk: Denne skanningen kan fungere som en referanse for fremtidig høyhastighets bildebehandling. Når ferdig med høy kvalitet scan, aktivere en time-lapse innstillingen for fangst. I time-lapse innstillinger, angi tidsintervallet til 5 min og total kjøretid til ønsket lengde (f.eks 5 timer). 'Bruk' disse innstillingene til den generelle scan. MERK: For å redusere denne skanningen tid til å tillate en 5 min tid forfalle intervall, kan man trenger å redusere antallet skanninger som brukes for sammenveiing, begrense oppløsningen til 512 x 512 piksler, konvertere skanning til toveis (med nødvendig fase korreksjon å justere både skanne retninger), og / eller øke skannehastighet til 600 Hz eller mer (mer enn 600Hz vil føre zooming på bildeområdet for den påviste programvareplattform). Det er også viktig å merke seg at mens en sekvensiell avbildningsmodus ble brukt til å få en høy kvalitet bildestakk i utgangspunktet, er samtidig oppkjøpet brukes til å øke hastigheten under time-lapse bildebehandling – dette kan resultere i noen liten krysstale mellom kanaler som legger ekstra betydning på det første fangst av nøyaktig adskilte referanse stabler. Starte imaging (som før ved å klikke på "Start"-knappen i demonstrert programvare). MERK: Sørg for å opprettholde riktig nivå av anestesi ved å administrere videre, mindre doser når det trengs, være forsiktig med å overdose musen, jevnlig fylle opp vann for å sikre at målet ikke tørker ut og overvåke vitale tegn og oppvarming-pad temperatur hele. Når du er ferdig, heve objektivet fra holderen og deretter fjerne holderen fra mikroskopet scenen, sikre ledningene fra rektalprobe og hspise mat ikke er skadet. Skru av hovedstillingen fra scenen holderen og fjern forsiktig musen. Cull musen med halshugging og fjerne metall head-brikke ved å klikke det av skallen. Lagre data til disk og overføre til server for senere analyse. MERK: Hodet brikke er ideell rengjøres ved å dyppe i aceton i noen timer og til slutt gni rester av sement av.

Representative Results

Den skreddersydde, gir høy presisjon museholderen inkludert en calvarium bildebehandling vindu langvarig avbildning av FACS rensede, merket HSPCs injiseres i lethally bestrålte mottaker mus (Figur 1a). Vanligvis, etter injeksjon av mellom 15 til 20.000 merkede celler, 8 til 15 celler er vanligvis gjenkjennelig i benmarg avbildning område av hodeskallen til følgende dag. Her vises det hvordan å skaffe enkelt celle oppløsning 3D stabler av HSPC holdige beinmargs områder på ca 90 – 120 mikrometer tykkelse, (figur 1B), etterfulgt av 4D-time-lapse filmer av HSPCs identifisert (figur 1C og film). Suboptimale resultater oppnås dersom dental sement ikke er optimalt fremstilt for eksempel vann kan lekke fra ikke-forseglede områder, og selv om det kan etterfylles fra toppen av holderen, en hvilken som helst tidsperiode i hvilken linsen er ikke dyppet i vann fører til svart f rames. Noen drift i bildene er uunngåelig på grunn av termisk ekspansjon av materialet i muse holderen, men det kan fremheves ved suboptimal sement adhesjon, noe som fører til progressiv løsgjøring av musen, og ved forstyrrelser av avbildnings satt opp, fører til brå hopp av fokus under time-lapse imaging. Drift under multi-point time-lapse imaging kan også være forårsaket av unøyaktigheter i den fasen bevegelser når borti tidligere fotografert stillinger. Drift og stutter artefakter i time-lapse filmer kan korrigeres for ved å bruke bilderegistrerings algoritmer. Tabell 1. Eksitasjon og innstillinger utslipps. Farge Channel Eksitasjon Utslipps GFP 13px; "> 488 nm 500-530 nm Autofluorescence 543 nm 560-610 nm VISSTe 633 nm 640-700 nm SHG 840 nm (MP) 400-450 nm Figur 1. In vivo 4D avbildning av HSPCs i muse calvarium. (A) omriss av eksperimentet (B – C).. Eksempler på resultater oppnådd (B) 2D skiver fra et 3D-stabel (total dybde er 114 mikrometer), som inneholder signal fra kollagen ben (hvit), gjorde merkede celler (røde) , autofluorescent cells (gul) og osteoblastiske celler (grønt). Skala barer:. 100 mikrometer (C) 2D skiver fra en 4D time-lapse film som viser en VISSTe merket HSC (rød) migrerer i nærhet av osteoblastiske celler (grønt). Den stiplede linjen belyser forskyvning av cellen. Skala barer: 50 um (B) og 100 mikrometer (C). MERK:. Den hentes fra time-lapse oppkjøpet i (C) filmen vises under videoen artikkelen Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Hva ble oppnådd?

Protokollen bruker time-lapse multi-dimensjonal avbildning å overvåke migrasjon av FACS renset, ex vivo merket, transplanterte HSPCs i mus calvarial benmarg. Merking av enkelt transplanterte cellene er oppnådd, og disse har vært overvåket over lengre perioder (t) med høy nøyaktighet. Puste indusert bevegelse gjenstander har blitt minimert og celler har gjentatte ganger blitt reimaged over lengre tid-kurset.

Hva er fremtidige retninger?

Utviklingen av teknikken kunne utvikle seg mot gjenvinning av eksperimenter for å muliggjøre avbildning på flere dager, i løpet av en uke eller mer, og bruken av gassbedøvelsesmidler slik som isofluran å forkorte og forenkle gjenopprettingsprosess for musen (Merk: recovery eksperimenter krever strengt sterile kirurgi forhold og forvaltning av aktuelle analgetika). Development av en større fargepalett av in vivo fargestoffer samt effektive genetisk merking av blodkreft cellene vil også legge til rette for multi-merking eksperimenter, gi mer innsikt i celle-celle interaksjoner i benmargen og tillate mer kompliserte eksperimenter i fremtiden. I tillegg vil samtidig merking av flere benmargs strukturer og Stroma komponenter gi et mer fullstendig bilde av hendelsene som finner sted i HSPC nisjer. Bilde stabiliteten av time-lapse filmer kan forbedres ved å stabil preacquisition mikroskopet videre, så vel som å minimalisere temperaturgradienter i prøven og postacquisition ved hjelp av bilderegistrerings algoritmer.

Begrensninger:

Teknikken som beskrives viser noen begrensninger. Survival of mus etter administrasjon av injiserbare bedøvelse er uforutsigbar, og det er veldig enkelt å oppleve komplikasjoner avhengig av individuell respons påbedøvelse. Vanligvis, jo lenger en avbildning sesjon, er det vanskeligere for musen å gjenopprette fra anestesi og det er derfor viktig å planlegge nøye om musen vil bli realisert, ideelt å begrense varigheten av tid forfalle imaging. Bruken av injiserbare anestetika begrenser brukstiden for hver avbildningssesjon kan vare. Mens det er mulig å forlenge anestesi ved readministering en mindre dose av bedøvelsesmiddel, er det vanskelig å utføre denne nøyaktig og dosering musen er en av de hyppigste årsaker til for tidlig avslutning av in vivo avbilding. Gass anestesi er mindre toksisk og gir en lengre innledende avbildningssesjon, men hurtig gjenvinning av musen etter> 2 timer lang behandling med isofluran er sjeldent vellykket. En annen begrensning av teknikken er det begrensede oppløsning av bildene som kan oppnås ved multi-point time-lapse avbildning, på grunn av nødvendigheten av å skaffe bilder hurtig. Dette, kombinert med fokus drift eller felt hopper (plateussed ovenfor), kan gjøre sporing av celler vanskelig.

Sammenligning med alternative metoder:

HSPCs er vanligvis merket med lipofile fargestoff gjorde, men Dir og Dii fargestoffer er likeverdige alternativer og andre cellefargestoffer kan brukes så lenge tilstrekkelig lys, som anmeldt i ^[16]. Selv om ex vivo merking av celler med gjorde har vist seg å ikke påvirke langtids funksjon av HSCs, har den begrensning at gjorde (eller andre kjemiske fargestoff) fortynnes ved celledeling. Siden HSCs sprer løpet av de første dager etter transplantasjon, forringes hurtig signal-til-støy-forholdet for disse cellene. Endogen merking av celler ved hjelp av genetisk manipulering og ekspresjon av fluorescerende proteiner er et levedyktig alternativ metode, så lenge som de fluorescerende proteiner er uttrykt ved tilstrekkelig høyt nivå til å generere signal påvises gjennom skallebenet. Det finnes en rekke alternative techniques tilgjengelig for å utføre avbildning av HSPCs i benmarg plass, hver med sine egne fordeler og begrensninger. Innsetting av fiberoptiske-baserte bildebehandlingsenheter tillatt for avbildning av benmarg tilberedning i lange bein ^[8], mens confocal bildebehandling etter kirurgisk eksponering av tibia og tynning av bein emalje med en kirurgisk drill ^[12] produsert detaljerte bilder av HSPCs bosatt i de perifere områdene av lange bein. Disse metodene er imidlertid langt mer omfattende enn det som er beskrevet her, og derfor ikke tillater å gjenta bilde sesjoner med fokus på samme benmargen område innenfor samme musen. Videre er det mulig at disse teknikkene kan påvirke cellene observert gitt den uunngåelige reaksjon omfattende skader i det omgivende vev. HSPCs har blitt avbildet i korte perioder gjennom dekkglass plassert over skåret, oppsprukne lårben ^[11], er ikke Clea men virkningen av dette tøffe utarbeidelse av vevet på HSPCsr og teknikk ble anvendt for å skaffe en unik enkelt tidspunktobservasjoner. Faste bein har vært delt inn i seriesnitt, farget, og de ​​innhentede bildene bygd om til en 3D-modell, gir utmerket 3D oppløsning, spesielt når vaskulære kaster brukes ^[17], og nylig Laser Scanning cytometri (LaSC) har blitt brukt til å skaffe kvantitative måler ca HSPCs i situ, markert med farging ^[18], men er ikke i stand til å gi noen tidsmessig informasjon om celler atferd. Teknikkene som beskrives i denne nye teknikken gir en kombinasjon av god oppløsning i 3D, tilstrekkelig midlertidig prøvetaking for overvåking av celler i 4D og de er relativt ikke-invasiv, derfor tilbyr en ideell tilnærming for å oppnå langsiktig overvåking av HSPCs samspill med benmargen mikromiljøet.

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Ketamine(Narketan 100mg/ml)	Vetoquinol	407575 0107 C	Other anesthetics may be used in place of this.
Medetomidine(Domitor 1mg/ml)	Elanco	134800-2	Other analgesics may b used in place of this.
Vibrant DiD cell labeling solution	Roche Products Ltd.	V22887	Other colors are available and may be used if required.
Lacrilube ophtalmic ointment	Allergan	n/a	avaliable by prescription by the local vet
Kemdent "Diamond Carve" glass ionomer cement	Associated Dental Products Ltd. via Kemdent	SUN527	We use shade A3, but any shade of cement can be used.
PBS	multiple equivalent	n/a
Sterile water	multiple equivalent	n/a
Insulin syringes	Terumo Medical Corporation	SS10M3109	1mL, 31G
Mouse restrainer	Harvard Apparatus	340031	Cone type (small)
Autoclaved forceps and scissors	Agar Scientific	AGT577 AGT5034	Iris scissors – 90mm; Dumont HP tweezers (0.06mm tip)
Weigh boat and cement stirrer	VWR	611-1996/231-0370	5mL weigh-boat (black)/ Wooden tongue depressor
Leica SP5 upright confocal microscope with motorized stage and two-photon laser	Leica Microsystems	Not available	Call for quote
25x water dipping objective lens (N.A. = 0.95)	Leica Microsystems	11506323	HCX IRAPO L lens
Custom designed mouse holder	Imperial College Engineering Workshop	N/A	See Figure 1 for details
Heating pad with rectal thermometer probe	BASi Instrumentation	FHC-40902/ FHC-40908/ FHC-4090502	Heat mat/ Control box/ Thermometer probe