En roman microdissection tilnærming til Gjenopprette<em> Mycobacterium tuberculosis</em> Spesifikke Utskrift fra formalinfiksert parafin Embedded Lung Granulomer
Summary
Mikrodisseksjon har blitt omfattende anvendt for undersøkelse av DNA, RNA og protein i vev. Laser-fangst mikroskopi (LCM) er den mest brukte metoden, men en ny maleteknikk, mesodissection, er nylig tilgjengelig. Vi demonstrerer RNA ekstraksjon fra mesodissected formalinfiksert parafin innebygde vev lysbilder av Mycobacterium tuberculosis granulomer.
Abstract
Microdissection har blitt brukt for undersøkelse av vev ved DNA, RNA og proteinnivåer i over et tiår. Laser-fangst mikroskopi (LCM) er den vanligste microdissection teknikk som brukes i dag. I denne teknikken blir en laser anvendes for å focally smelte en termoplastisk membran som ligger over en dehydrert vev delen 1. Vevet seksjonen kompositt blir så løftet, og skilt fra membranen. Selv om denne teknikken kan brukes med hell for vev eksamen bli, er det tidkrevende og kostbart. Videre er en vellykket gjennomføring av fremgangsmåten ved hjelp av denne teknikk krever bruk av en laser, og dermed begrenser dens bruk. En ny mer rimelig og praktisk microdissection tilnærming kalt mesodissection er en mulig løsning på fallgrubene LCM. Denne teknikken benytter MESO-1/MeSectr for fresing det ønskede vev fra et lysbilde montert vevsprøve mens samtidig dispensering og aspirering av fluidet for å gjenopprette det ønskede vevet prøven ien forbruks mill bit. Før disseksjon prosessen begynner, justerer brukeren formalinfiksert parafin innebygd (FFPE) skyv med en hematoxylin og eosin farget (H & E) referanse lysbilde. Deretter annotates operatøren ønsket disseksjon området og fortsetter å dissekere det aktuelle segmentet. Programmet genererer en arkivert bilde av disseksjon. Den største fordelen med mesodissection er den korte varigheten nødvendig å dissekere en sklie, tar i gjennomsnitt ti minutter fra satt opp for å prøve generasjon i dette eksperimentet. I tillegg er systemet betydelig mer kostnadseffektiv og brukervennlig. En viss ulempe er at det ikke er så nøyaktige som laser-fangst mikroskopi. I denne artikkelen viser vi hvordan mesodissection kan brukes til å trekke RNA fra lysbilder fra FFPE granulomer forårsaket av Mycobacterium tuberculosis (Mtb).
Introduction
Prøvene har tradisjonelt blitt manuelt microdissected fra enten hel vev eller lysbilder ved hjelp av en nål og skalpell. Dette nødvendiggjør et klart skille mellom vev del av interesse og omkringliggende vev seksjoner 2. Med dagens fremskritt i molekylær profilering teknologi, har det vært et økende behov for å vurdere vev på cellenivå. På grunn av begrensninger i manuell microdissection, ble teknikker, inkludert LCM etablert for å tillate større isolasjon presisjon. Denne teknikken gjør det mulig for forskeren til å isolere spesifikke cellepopulasjoner fra forskjellige celle-og glidetyper, som deretter kan brukes til nedstrøms assays slik som genekspresjon profilering. Men svært effektive for nedstrøms analyser, er LCM ikke uten begrensninger. Først, er LCM en kostbar og tidkrevende prosess. I tillegg, som følge av den ustabile natur av RNA, er det ofte vanskelig å oppnå høy kvalitet RNA fra LCM prøvene 2. På grunn av disadvantages av LCM, nye fremskritt i microdissection teknologi fortsatt behov for å gjøre det mer tilgjengelig for et større antall forskere i en rimelig og tid følsom måte.
En slik utvikling i microdissection teknologi nå er tilgjengelig er en teknikk kjent som mesodissection. I denne teknikken en maskin blir brukt til å male den kommenterte vev del av interesse og aspirerer den til en forbruks mill bit tre. Deretter kan denne prøven suges inn i en samling rør og brukes til nedstrøms applikasjoner. Fordelene med dette system er at det er betydelig mindre kostbare og tidsfølsomme. I vår erfaring, gjør at systemet disseksjon av en lunge granulomer vev delen i ti minutter. På den annen side, ville tradisjonell LCM trolig kreve timer å fullføre prosessen. Systemet gjør det mulig for operatøren å laste en referanse lysbilde å bruke som en sammenligning samt verktøy for merknader. I tillegg en rapport genereres skisserte the område av raset som ble dissekert. Det er to største ulempene til mesodissection. Selv om effektiv til å trekke ut flere celler, er det vanskelig å isolere en enkelt celle. I tillegg, er presisjonen av bildet genereres ikke er så tydelig som ved bruk av andre imaging mikroskoper.
Tuberkulose (TB) er en stor infeksjonssykdom morder av menneskeheten over hele verden og resultater fra infeksjon med Mtb. I et flertall av individer som er utsatt for aerosoler av Mtb blir infeksjonen latent begrenset. I minst 10 millioner mennesker årlig, resulterer det i aktiv TB sykdom fire. Under latent infeksjon, er Mtb finnes patologiske lunge lesjoner som kalles granulomer. Derfor har det blitt hevdet at utfallet av Mtb infeksjon er besluttet på nivået av granulomer fem.
Her viser vi hvordan mesodissection kan brukes til å microdissect granulomer forårsaket av Mtb. Lysbildene brukeser fra FFPE lungevev fra infiserte rhesus-aper. For hensikten med denne demonstrasjonen, vil vi dissekere granulomer i sin helhet. Vi viser også at RNA kan hentes ut fra den gjen vev. Denne teknikken kan brukes til vevsprøver fra en rekke andre prøver, og deretter brukt for en rekke nedstrøms assays.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mesodissection er en teknikk som kan brukes til RNA ekstraksjon fra patologisk lesjon lysbilder forårsaket av et stort utvalg av patogener. Det er en nødvendighet at brukeren sporer bildet og justerer bildet riktig. For å oppnå dette, må instrumentet kalibreres følge instruksjonene på bildebehandlingsprogrammer. Når dissekere, hvis raset og område av interesse blir dissekert ikke justere, må brukeren kalibrere instrumentet. Et annet kritisk punkt i disseksjon prosessen er å laste konsumerbar møllen bit på e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å takke følgende NIH utmerkelser / subawards for støtte til denne forskningen: R01HL106790, R01HL106790-S1, R01HL106786, R01AI089323, R21AI091457, R21RR026006, P20RR020159, C06RR017563, 8T32OD011124-08, og P51OD011104.
Materials
| MeSectr | AvanSci Bio | Mesodissector | |
| 400 nm xScisors | AvanSci Bio | Other sizes available | |
| THOR | AvanSci Bio | Programmable Heater-Shaker | |
| NanoDrop2000 | ThermoScientific | ND-2000 | |
| RNeasy FFPE extraction kit | Qiagen | 73504 | |
| Ovation RNA-Seq FFPE System | Nugen | 7150 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 |
References
- Fend, F., Raffeld, M. Laser capture microdissection in pathology. J Clin Pathol. 53 (9), 666-672 (2000).
- Esposito, G. Complementary techniques: laser capture microdissection–increasing specificity of gene expression profiling of cancer specimens. Adv Exp Med Biol. 593, 54-65 (2007).
- Adey, N., Bosh, D., Emery, D., Birch, L., Parry, R. Mesodissection of Paraffin Embedded Slide Mounted Tissue Sections. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (6), (2012).
- Fleischmann, R. D., Alland, D., Eisen, J. A., Carpenter, L., White, O., Peterson, J., et al. Whole-genome comparison of Mycobacterium tuberculosis clinical and laboratory strains. J Bacteriol. 184 (19), 5479-5490 (2002).
- Russell, D. G., Barry 3rd, C. E., Flynn, J. L. Tuberculosis: what we don’t know can, and does, hurt us. Science. 328 (5980), 852-856 (2010).
- . Mesodissection of fibrous tissue. AvanSciBio. , (2013).
- Paige, C., Bishai, W. R. Penitentiary or penthouse condo: the tuberculous granuloma from the microbe’s point of view. Cell Microbiol. 12 (3), 301-309 (2010).
- Mehra, S., Alvarez, X., Didier, P. J., Doyle, L. A., Blanchard, J. L., Lackner, A. A., et al. Granuloma correlates of protection against tuberculosis and mechanisms of immune modulation by Mycobacterium tuberculosis. J Infect Dis. 207 (7), 1115-1127 (2013).
- Kaushal, D., Schroeder, B. G., Tyagi, S., Yoshimatsu, T., Scott, C., Ko, C., et al. Reduced immunopathology and mortality despite tissue persistence in a Mycobacterium tuberculosis mutant lacking alternative sigma factor, SigH. Proc Natl Acad Sci U S A. (12), 8330-8335 (2002).
- Mehra, S., Kaushal, D. Functional genomics reveals extended roles of the Mycobacterium tuberculosis stress response factor sigmaH. J Bacteriol. 191 (12), 3965-3980 (2009).
- Rohde, K. H., Veiga, D. F., Caldwell, S., Balazsi, G., Russell, D. G. Linking the transcriptional profiles and the physiological states of Mycobacterium tuberculosis during an extended intracellular infection. PLoS Pathog. 8 (6), (2012).
- Fontan, P. A., Voskuil, M. I., Gomez, M., Tan, D., Pardini, M., Manganelli, R., et al. The Mycobacterium tuberculosis sigma factor sigmaB is required for full response to cell envelope stress and hypoxia in vitro, but it is dispensable for in vivo growth. J Bacteriol. 191 (18), 5628-5633 (2009).
- Rustad, T. R., Harrell, M. I., Liao, R., Sherman, D. R. The enduring hypoxic response of Mycobacterium tuberculosis. PLoS One. 3 (1), (2008).
