A Novel microdissection tilgang til Recovering<em> Mycobacterium tuberculosis</em> Specifikke Udskrifter fra Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomer
Summary
Mikrodissektion er blevet grundigt ansat til undersøgelse af DNA, RNA og protein i vævet. Laser capture mikroskopi (LCM) er den mest anvendte metode, men en ny fræsning teknik, mesodissection, er for nylig tilgængelig. Vi viser RNA ekstraktion fra mesodissected formalin fast paraffin indlejret vævsobjektglassene af Mycobacterium tuberculosis granulomer.
Abstract
Mikrodissektion har været anvendt til undersøgelse af væv på DNA, RNA og protein niveau i over et årti. Laser-mikroskopi (LCM) er den mest almindelige mikrodissektion teknik anvendes i dag. I denne teknik, er en laser, der anvendes til focally smelte en termoplastisk membran, der ligger over en dehydreret væv § 1. Den sammensatte vævssnit løftes derefter og adskilles fra membranen. Selv om denne teknik kan anvendes med succes til vævsundersøgelse, det er tidskrævende og dyrt. Desuden den vellykkede afslutning af procedurer ved hjælp af denne teknik kræver brug af en laser, hvilket begrænser dets anvendelse. En ny og mere overkommelige og praktisk mikrodissektion model kaldet mesodissection er en mulig løsning på faldgruberne i LCM. Denne teknik anvender MESO-1/MeSectr systemet mølle det ønskede væv fra et dias monteret vævsprøve mens samtidig dispensering og aspiration af væske til at genoprette den ønskede vævsprøve inden forbrugsvare mølle bit. Før dissektion proces begynder, brugeren justerer formalinfikseret paraffin indlejret (FFPE) glide med en hæmatoxylin og eosin farves (H & E) henvisning dias. Derefter operatøren annotates det ønskede dissektion området og provenuet til at dissekere den relevante kategori. Programmet genererer en arkiveret billede af dissektion. Den største fordel ved mesodissection er den korte varighed nødvendigt at dissekere et objektglas, idet et gennemsnit på ti minutter fra sat op til at prøve generation i dette eksperiment. Derudover er systemet betydeligt mere omkostningseffektiv og brugervenlig. En lille ulempe er, at det ikke er så præcis som laser-mikroskopi. I denne artikel vil vi vise, hvordan mesodissection kan bruges til at udtrække RNA fra lysbilleder fra FFPE granulomer forårsaget af Mycobacterium tuberculosis (Mtb).
Introduction
Prøver har traditionelt været manuelt mikrodissekeres fra enten hele væv eller dias ved hjælp af en nål og skalpel. Dette nødvendiggør en klar adskillelse mellem vævssnittet af interesse og omgivende væv afsnit 2. Med de nuværende fremskridt inden for molekylær profilering teknologi, har der været et stigende behov for at vurdere væv på celleniveau. På grund af de begrænsninger af manuelle mikrodissektion blev teknikker, herunder LCM oprettet for at give mulighed for større isolation præcision. Denne teknik gør det muligt for forskeren at isolere bestemte cellepopulationer fra forskellige celle-og slide-typer, som derefter kan bruges til efterfølgende analyser såsom genekspression profilering. Selvom meget effektiv til downstream analyser, LCM er ikke uden begrænsninger. Først LCM er en dyr og tidskrævende proces. Derudover, på grund af den ustabile natur af RNA, er det ofte en udfordring at opnå en høj kvalitet RNA fra LCM prøverne 2. På grund af den disadvantages af LCM er nye fremskridt inden mikrodissektion teknologi stadig behov for at gøre det mere tilgængeligt for et større antal forskere i en overkommelig og tid følsom måde.
En sådan avancement i mikrodissektion teknologien nu til rådighed, er en teknik kendt som mesodissection. I denne teknik en maskine der bruges til mølle den kommenterede vævssnittet af interesse og aspirerer det ind i en forbrugsvare mølle bit 3. Dernæst kan denne prøve blive suget ind i et opsamlingsrør og anvendes til efterfølgende anvendelser. Fordelene ved dette system er, at det er betydeligt billigere og tidsfølsomme. Det er vores erfaring, at systemet giver mulighed for dissektion af en lunge granulom vævssnit i ti minutter. På den anden side ville traditionelle LCM sandsynligvis kræve timer at fuldføre processen. Systemet gør det muligt for operatøren at indlæse en henvisning dias til at bruge som en sammenligning samt værktøj til anmærkning. Derudover en rapport genereres skitserer the område af dias, der blev dissekeret. Der er to primære ulemper mesodissection. Skønt effektiv til at ekstrahere flere celler er det udfordrende at isolere en enkelt celle. Hertil kommer, at præcisionen af billedet genereret er ikke så klar, som hvis du bruger andre billeddiagnostiske mikroskoper.
Tuberkulose (TB) er en stor smitsom sygdom dræber af hele menneskeheden og resultater fra infektion med Mtb. I et flertal af personer udsat for aerosoler af Mtb er infektionen latent begrænset. I mindst 10 millioner mennesker om året, resulterer det i aktiv TB sygdom 4. Under latent infektion er Mtb indeholdt i patologiske lungelæsioner kendt som granulomer. Derfor er det blevet hævdet, at udfaldet af Mtb infektion besluttes på niveau med granuloma 5..
Her viser vi, hvordan mesodissection kan bruges til at microdissect granulomer forårsaget af Mtb. De slides anvendteer fra FFPE lungevæv fra inficerede makakaber. Med henblik på denne demonstration vil vi dissekere granulomer i deres helhed. Vi viser også, at RNA kan ekstraheres fra det udvundne væv. Denne teknik kan anvendes på vævsprøver fra forskellige andre enheder og derefter anvendes til en række efterfølgende assays.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mesodissection er en teknik, der kan anvendes til RNA ekstraktion fra patologiske læsioner dias forårsaget af en bred vifte af patogener. Det er en nødvendighed, at brugeren sporer billede og justerer billedet korrekt. For at opnå dette, skal instrumentet kalibreres efter anvisningerne på imaging software. Ved dissekering, hvis det dias og interesseområde bliver dissekeret ikke justere, skal brugeren kalibrere instrumentet. Et andet afgørende skridt i dissektion processen er at indlæse forbrugsmaterialer mølle …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne anerkende følgende NIH uddeler / subawards til støtte af denne forskning: R01HL106790, R01HL106790-S1, R01HL106786, R01AI089323, R21AI091457, R21RR026006, P20RR020159, C06RR017563, 8T32OD011124-08, og P51OD011104.
Materials
| MeSectr | AvanSci Bio | Mesodissector | |
| 400 nm xScisors | AvanSci Bio | Other sizes available | |
| THOR | AvanSci Bio | Programmable Heater-Shaker | |
| NanoDrop2000 | ThermoScientific | ND-2000 | |
| RNeasy FFPE extraction kit | Qiagen | 73504 | |
| Ovation RNA-Seq FFPE System | Nugen | 7150 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 |
References
- Fend, F., Raffeld, M. Laser capture microdissection in pathology. J Clin Pathol. 53 (9), 666-672 (2000).
- Esposito, G. Complementary techniques: laser capture microdissection–increasing specificity of gene expression profiling of cancer specimens. Adv Exp Med Biol. 593, 54-65 (2007).
- Adey, N., Bosh, D., Emery, D., Birch, L., Parry, R. Mesodissection of Paraffin Embedded Slide Mounted Tissue Sections. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (6), (2012).
- Fleischmann, R. D., Alland, D., Eisen, J. A., Carpenter, L., White, O., Peterson, J., et al. Whole-genome comparison of Mycobacterium tuberculosis clinical and laboratory strains. J Bacteriol. 184 (19), 5479-5490 (2002).
- Russell, D. G., Barry 3rd, C. E., Flynn, J. L. Tuberculosis: what we don’t know can, and does, hurt us. Science. 328 (5980), 852-856 (2010).
- . Mesodissection of fibrous tissue. AvanSciBio. , (2013).
- Paige, C., Bishai, W. R. Penitentiary or penthouse condo: the tuberculous granuloma from the microbe’s point of view. Cell Microbiol. 12 (3), 301-309 (2010).
- Mehra, S., Alvarez, X., Didier, P. J., Doyle, L. A., Blanchard, J. L., Lackner, A. A., et al. Granuloma correlates of protection against tuberculosis and mechanisms of immune modulation by Mycobacterium tuberculosis. J Infect Dis. 207 (7), 1115-1127 (2013).
- Kaushal, D., Schroeder, B. G., Tyagi, S., Yoshimatsu, T., Scott, C., Ko, C., et al. Reduced immunopathology and mortality despite tissue persistence in a Mycobacterium tuberculosis mutant lacking alternative sigma factor, SigH. Proc Natl Acad Sci U S A. (12), 8330-8335 (2002).
- Mehra, S., Kaushal, D. Functional genomics reveals extended roles of the Mycobacterium tuberculosis stress response factor sigmaH. J Bacteriol. 191 (12), 3965-3980 (2009).
- Rohde, K. H., Veiga, D. F., Caldwell, S., Balazsi, G., Russell, D. G. Linking the transcriptional profiles and the physiological states of Mycobacterium tuberculosis during an extended intracellular infection. PLoS Pathog. 8 (6), (2012).
- Fontan, P. A., Voskuil, M. I., Gomez, M., Tan, D., Pardini, M., Manganelli, R., et al. The Mycobacterium tuberculosis sigma factor sigmaB is required for full response to cell envelope stress and hypoxia in vitro, but it is dispensable for in vivo growth. J Bacteriol. 191 (18), 5628-5633 (2009).
- Rustad, T. R., Harrell, M. I., Liao, R., Sherman, D. R. The enduring hypoxic response of Mycobacterium tuberculosis. PLoS One. 3 (1), (2008).
