The zebrafish is a powerful model system for developmental biology and human disease research due to their genetic similarity with higher vertebrates. This protocol describes a methodology to create haploid zebrafish embryos that can be utilized for forward screen strategies to identify recessive mutations in genes essential for early embryogenesis.
Zebrafisken er blevet en mainstream hvirveldyr model, der er relevant for mange discipliner videnskabelig undersøgelse. Zebrafisk er specielt velegnet til fremad genetisk analyse af udviklingsprocesser på grund af deres ydre befrugtning, embryonale størrelse, hurtig ontogeni og optisk klarhed – en konstellation af træk, der muliggør direkte observation af arrangementer lige fra gastrulation til organogenese med en grundlæggende stereomikroskop. Endvidere kan zebrafisk embryoner overleve i flere dage i haploid tilstand. Produktionen af haploide fostre in vitro er et kraftfuldt værktøj til mutationsanalyse, da den gør det muligt at identificere recessive mutantalleler til stede i første generation (F1) kvindelige bærere efter mutagenese i forældrenes (P) generation. Denne fremgangsmåde eliminerer behovet for at gøre flere generationer (F2, F3, etc.), som indebærer opdræt af mutante familier, og dermed spare forskeren tid sammen med at reducerebehovene for zebrafisk koloni plads, arbejdskraft og opdrætsmetoder omkostninger. Selv zebrafisk er blevet brugt til at foretage videre skærme for de sidste mange årtier har der været en støt udvidelse af transgene og genom-redigeringsværktøjer. Disse værktøjer nu tilbyde et væld af måder at skabe nuancerede analyser for næste generation af skærme, der kan bruges til yderligere at dissekere gen regulerende netværk, der drev hvirveldyr ontogeni. Her beskriver vi, hvordan man forbereder haploide zebrafisk embryoner. Denne protokol kan implementeres for nye fremtidige haploide skærme, såsom i forstærker og suppressor skærme, for at løse de mekanismer for udvikling af en bred række processer og væv, der danner i den tidlige embryonale stadier.
De grundlæggende processer, der orkestrere hvirveldyr udvikling er stort set bevaret 1. En kraftfuld måde at identificere gener med vigtige roller i udviklingen er at isolere arvelige mutationer, der fører til fænotypiske defekter i processen med interesse. Den zebrafisk, Danio rerio, er en lille ferskvand teleost arter, der tilhører Cyprinidae fisk familie, der er blevet en udbredt model organisme til hvirveldyr udviklingsmæssige genetik i løbet af de sidste årtier 2. Zebrafisk æg befrugtet eksternt, tillader adgang til det zygote fra starten af befrugtning 3. Endvidere tidlige embryo er optisk transparent, muliggør visualisering af udvikling med en simpel stereomikroskop 3. Zebrafisk ontogenese er hurtig, og de processer af spaltning gastrulation og organogenese mange strukturer, såsom hjerte og nyre, som afsluttet i løbet af den første dag i udvikling 3. Than tid fra larvestadier til kønsmodenhed tager 2-3 måneder, og de voksne er små hvirveldyr ca 3-4 cm i længden, kan så mange fisk opretholdes i minimal plads 2. Desuden zebrafisk voksne har høj frugtbarhed, med hver fisk i stand til at producere flere hundrede embryoner pr uge 2. Disse egenskaber har gjort sporbarhed zebrafisk for frem og bak genetiske skærme. Zebrafisk besidder en høj grad af beskyttelse i deres anatomi, cellebiologi og fysiologi med mere avancerede hvirveldyr arter som pattedyr 2,4. Faktisk har de seneste sekvens analyse viste, at zebrafisk genom indeholder homologer til næsten 70% af menneskelige gener 5. Denne bevarelse har gjort det muligt for forskerne at bruge zebrafisk som model for mange menneskelige sygdomme, herunder både embryonale og voksne forhold 2,4. Tilsammen har disse faktorer gjorde zebrafisk et fremragende system til skærme henblik på at identificere gener, der erafgørende for en normal hvirveldyr ontogenese.
En række store skærme er blevet udført i zebrafisk og har identificeret flere tusinde mutationer i udviklingsmæssige gener 6-8. Zebrafisk voksne mand er modtagelig for mutagenese, og kromosomale ændringer kan genereres med relativt høj frekvens ved kemisk mutagen ethylnitrosourinstof (ENU) 6,7 eller retroviral insertionsmutagenese 9. Til dato er blevet skabt over 9.000 arvelige mutationer, og omfatter gener, der påvirker næsten alle aspekter af embryogenese. Zebrafisk samfund har etableret en central bank af disse mutanter på zebrafisk International Resource Center (eller Zirc) 10, der har indsamlet cirka 5.000 mutant og transgene alleler fra hele verden. Mange af disse mutationer er blevet analyseret og klonet, hvilket giver forskere på tværs af biologiske discipliner værdifulde oplysninger, der er blevet brugt til at drille hinanden numeroos cellulære og fysiologiske veje gennem de indsigter oprindelse med zebrafisk eksperimenter.
Selv forward skærme har identificeret et imponerende antal vigtige gener, meget mangler endnu at blive værdsat om genetiske regulerende netværk, der medierer et utal af processer. Mange skærme foretaget hidtil ikke har nået et mætningspunkt, og dermed fremad samt reverse genetiske skærme er forblevet en hjørnesten for at identificere og analysere mekanismer embryogenese. Mens der er enorme indsigt, der kan udledes en enkelt zebrafisk mutant linje er en væsentlig begrænsende faktor i marken historisk set været den tidskrævende indsats, der er involveret i positionel kloning. Af denne grund har identiteten af mange kemisk inducerede mutationer var et mysterium. Men med den seneste fremkomsten af hele genomsekventering tilgange, der letter hurtig kloning 11-14, utrolig effektiv identifikation af genetiske mutationer er nu feasible.
Den prototypiske fremad skærm i zebrafisk er en diploid skærm, der kan identificere recessive mutationer inden for tre generationer 6,7 (fig. 1, venstre spalte). Denne teknik indebærer at generere mutationer i kimceller forældrenes (P) Mand, og derefter parre denne mand med en vildtype kvindelige. Hver af første generation (F1) afkom fra denne parring harbor én eller flere unikke mutationer på grund af de kromosomale bidrag fra den muterede paternelle genom. Afkom F1 er rejst, og udkrydsede med vilde typer til at skabe F2 familier. I F2 familie, vil søskende være enten vildtype eller heterozygote bærere og er incrossed tilfældigt at generere F3 koblinger, der analyseres for fænotype (r) af interesse. F3 kløerne på heterozygote bærere vil indeholde 25% vildtype, 50% heterozygot og 25% homozygote mutant fisk. Denne multi-generationsskifte screening skema er effektiv, men en stor ulempe til dette enMETODE omfatter den tid, der kræves for at forberede sig til skærmen: mindst 1 års fisk dyrehold alene er involveret, da hver generation kræver omkring 3 måneder til kønsmodne. Andre begrænsninger af denne type af diploide skærmen er arbejde, plads og boligudgifter disse generationer.
Det haploide skærmen er en alternativ, der kan anvendes til at identificere og derefter isolere recessive mutationer under anvendelse af lignende mutagenese-strategier 15 (fig. 1, højre kolonne). Produktionen af haploide zebrafisk embryoner blev først beskrevet mere end 30 år siden 16, og evnen af den normalt diploide zebrafisk at udvikle til flere dage med en haploid kromosomalt ploidi er blevet anvendt til en lang række genetiske undersøgelser, da dette tidspunkt. Den største fordel af det haploide skærm er, at denne metode ikke indebærer hæve F2 familier med henblik på at screene for recessive mutantalleler. I stedet er de hunner F1 generation evalueret forheterozygositet af recessive mutationer i processen af interesse ved at undersøge deres F2-afkom i haploid tilstand (fig. 1, højre spalte). Samlet set er de skridt til at skaffe haploide embryoner er forholdsvis ligetil (Figur 2). Efter fremstilling af de nødvendige løsninger for sperm håndtering, er æg fra F1 generation hunner ved manuel manipulation, således at ekstrudere (eller "klemme"), æg fra maven. Når æggene er fremstillet, er de befrugtet in vitro ved udsættelse for ultraviolet (UV) inaktiveret sædceller. UV inaktiverede sæd er i stand til at bidrage levedygtige DNA til ægget på grund af det faktum, at kortbølget UV krydsbinder faderens DNA. Men sædcellerne er stadig i stand til at udløse æg aktivitet og de begivenheder, der er forbundet med zygotisk udvikling. Ved metabolisk aktivering, vil ægget fuldføre meiose II, og fortsætte med at udvikle med kun én moderen deponerede kopi af hver chromosomig. På grund af denne 1N ploidi embryonet er underlagt de udviklingsmæssige konsekvenser af en recessiv mutant allel, hvis det er til stede på en maternel kromosom. Således hver F2 haploide kobling vil indeholde 50% vildtype og 50% mutant embryoner, hvis moderen er en heterozygot bærer af en fuldt gennemgribende recessive allel. Denne fordeling af embryonale genotyper muliggør relativ lethed i form af evaluering af koblingen for tilstedeværelsen af mutantfænotypen (r) af interesse. Hvis der konstateres en sådan en fænotype, er F1 generation kvindelige grundlægger efterfølgende udkrydsede til vildtype mandlige zebrafisk til at oprette og hæve flere heterozygote bærere. Fordi det ikke er nødvendigt at hæve flere generationer til at udføre skærmen, kan forskeren spare megen tid, arbejdskraft og akvarium plads, men stadig har magt til at overskue et betydeligt antal genomer baseret på antallet af F1-hunner undersøgt. Således haploide skærme er særligt muligt for små laboratorier eller projekter iværksat i absence af betydelige midler.
Der er imidlertid flere begrænsninger og ulemper ved anvendelsen af haploider. Først haploide zebrafisk embryoner lever kun flere dage, og typisk dør mellem 3 og 5 dage efter befrugtning (DPF) 15. Haploide zebrafisk embryoner kan skelnes fra diploider baseret på flere egenskaber, først og fremmest blandt dem er en kort og tætbygget krop, der ikke desto mindre har det normale antal somite segmenter 15,17. Som udvikling skrider frem, hjernen udviser forøget celledød og cirkulation er dårlig, som regel forbundet med blodophobning med 2-3 dpf og ødem 15,17. Endvidere haploider undlader at oppuste en svømmeblære 15,17. Uanset disse morfologiske forskelle, er de fleste vigtige organer og væv dannet, herunder hjertet, øjet, og notochord 15,17. En funktion bemærkede om haploide koblinger er, at de indeholder en vifte af fænotyper i form af sorter af defekte embryoer & #8212; en funktion observeret på tværs af zebrafisk stammer. Således bør man kontrollere, om vævet (e) og tid punkt af interesse viser rimelig normal udvikling i vildtype haploide stamme og derfor har potentiale til at blive evalueret for genetiske defekter i en skærm eller andet forskningsprojekt.
På trods af disse udfordringer har haploide skærme er blevet gennemført med succes at identificere gener, der er nødvendige for tidlige udviklingsprocesser i zebrafisk, og haploide protokoller er blevet godt etableret ressourcer i samfundet i mange år 15-19. For nylig er processen med at generere haploide fisk embryoner blevet brugt af forskere til at skabe haploide embryonale stamceller (ES) cellekulturer fra Medaka fisk 20,21. Efter fremstilling af Medaka haploide fostre in vitro blev embryoner anvendes til at aflede primære cellekulturer, der blev passeret i 15 uger efterfulgt af yderligere 5-8 uger at frembringe rene kloner af haploide celler medES celle egenskaber 15-19. Den generation af fisk haploide ES-cellelinjer besidder bred fremtidig løfte til analyse recessive fænotyper i hvirveldyr celleafstamninger, og repræsenterer en ny tilgang til genetisk analyse i de kommende år. Således har generation af haploide fisk embryoner voksende applikationer i den biomedicinske forskningsverden. Denne video artikel giver en visuel demonstration af de skridt, der er involveret med at producere haploide zebrafisk embryoner in vitro ved hjælp af UV-inaktiveret sperm baseret på etablerede protokoller 15-19,22.
Haploide screening er en nyttig teknik til at opdage væsentlige gener nødvendige for tidlige udviklingsstadier. Endvidere har dyrkning af haploide celler fra Medaka fisk blevet brugt til at isolere ES-lignende cellelinier, der har mange forsknings-applikationer og muligheder, der viser, at haploide celler kan give en værdifuld fremtidig mødested for andre typer af hvirveldyr genetiske undersøgelser 20,21. Denne protokol giver en demonstration af de involverede med at udføre produktionen af haploide zebrafisk embryoner gennem in vitro-befrugtning med UV inaktiveret sperm metoder. Denne metode kan bruges til at udføre frem haploide skærme med mutageniserede F1 fisk, hvilket kan gøres ved hjælp af vildtype, transgene eller mutantstammer til forstærker / suppressor screening.
Selvom screeningen tid ved hjælp af en haploidt strategi langt er afkortet i forhold til diploide screening, vil det dog tage flere måneder at gennemføre. Som vi descriseng tidligere, der er mange fordele, der findes ved at udføre en skærm ved hjælp af en haploide skema, som alle kan støtte i at gøre nye bidrag til den aktuelle viden om en række udviklingsmæssige begivenheder. Det haploide skærm metoden er mere effektiv til identificering af recessive mutantalleler end diploide-baserede skærme på grund af reduktion af tid, plads og antallet af fisk, der er nødvendige. Der er imidlertid flere faldgruber en haploid skærm. En haploidt skærm kan kun identificere mutanter i gener, der er aktive inden for de første par dage af udvikling, da fosteret kun kan overleve i en begrænset periode med en haploidgenom. Gener, der udtrykkes senere i udviklingen skulle identificeres ved en anden metode, såsom en diploid skærm. Også, nogle organer ikke udvikle sig ordentligt i en haploid organisme. Der kan være anatomiske abnormiteter eller en forsinket tidspunkt i udviklingen, som kan forårsage mutationen at blive savnet af det haploide screening teknik. Jegn kommer, at nogle stammer af fisk ikke udvikle sig så godt i en haploid tilstand 15. Haploider kan kategoriseres efter en klassificering serie af gode, mellemliggende og fattige embryonale funktioner med embryoner er den mest normale, B til at udpege embryoner med defekter i aksen, men et klart hoved og hale, og C / D til at udpege embryoner med uigenkendelige funktioner (Masser af celler oven æggeblomme bolde) 15,17. Andelene af embryoner inden for disse kategorier varierer fra zebrafisk stamme, med øget antal af bedre kvalitet haploider mere fremherskende i bestemte genetiske baggrunde 15,17. På grund af disse faktorer, er det nødvendigt at finde en ordentlig stamme af zebrafisk at udføre mutagenese og efterfølgende kors. I vores seneste erfaringer vildtype Tübingen stammen producerede levedygtige haploider til screening (som vist i figur 3 og 4), selv om historisk zebrafisk forskere har udnyttet AB eller AB * stammer til haploidt experimtation 15.
Ud over disse førnævnte udfordringer vil ikke alle primede voksen zebrafisk hunner en kobling ved udførelse af klemme teknik. For eksempel i arbejdet med ENU-mutageniseret Tübingen strain hunner, omkring halvdelen af alle kvinder produceret en kobling ved at klemme, og nogle brøkdel af disse (typisk 10-30%) var dårlig embryo kvalitet eller ikke kunne blive befrugtet. Således at udføre en haploidt skærm skal man planlægger at rejse mindst dobbelt så mange fisk som nødvendigt at screene det ønskede antal genomer (hver hun repræsenterer et genom screenet). Uanset denne betragtning, at fordelene ved det haploide fremgangsmåde til screening til at dække store antal af genomer uden en massiv dyrefacilitet er faktisk ganske betydelig, hvis assayet er modtagelig for det haploide tilstand. Imidlertid bør det også bemærkes, at yderligere undersøgelse af mutationen (r) identificeres i det haploide kobling er helt afhængig af succes hæve enn udkryds fra den kvindelige grundlægger. Som med enhver skærm, 'hits' oprindelig identificeret under screeningen proces skal være re-identificeret i den diploide tilstand.
På trods af de faldgruber ved at bruge det haploide skærm, har det vist sig at være meget vellykket i at identificere mutanter, der er blevet analyseret i dybden med indsigtsfulde gevinster til det videnskabelige felt 15. Haploide skærme kan gennemføres for at undersøge andre dårligt forståede processer hvirveldyr udvikling. Brug haploider til forstærker og suppressor-skærme er en måde at få mere indsigt i de aktiviteter og regulerende netværk af et gen af interesse. Det haploide screening teknik kan også anvendes til at identificere enhancere og suppressorer af mutanter, der allerede er blevet isoleret ved fremgangsmåder, såsom kemisk eller insertionsmutagenese eller omvendt genetik tilgange som TILLING eller TALENS. Kort sagt kan det tidligere isolerede mutant mutageniseres med ENU og screenes for enhancere eller suppressors i den oprindelige mutant fænotype. Mutanten skal være i stand til at nå voksne stadier, så det er nødvendigt at have en heterozygot dyr eller en svag homozygot mutant fisk til at udføre denne skærm, men nylige fremskridt inden for gensplejsning har gjort det muligt for forskerne at skørtet dette problem. At lære at manipulere veje i udviklingen kan føre til mange spændende muligheder, herunder udsigten til forstyrrende veje til at behandle sygdomstilstande.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af finansiering til RAW fra følgende: NIH tilskud K01 DK083512, DP2 OD008470 og R01 DK100237; March of Dimes Basil O'Connor Starter Scholar Award # 5-FY12-75; opstart midler fra University of Notre Dame College of Science og Biologisk Institut; og en generøs gave til University of Notre Dame fra Elizabeth og Michael Gallagher på vegne af Gallagher Family at fremme stamcelleforskning. De finansieringskilderne havde nogen rolle i undersøgelsens design, dataindsamling og-analyse, beslutning om at offentliggøre, eller udarbejdelse af manuskriptet. Vi takker stabe af Biologisk Institut for deres støtte, og Center for zebrafisk Forskning på Notre Dame for deres enestående engagement i pleje og velfærd for vores zebrafisk koloni. Vi takker GF Gerlach for at tage fotografier, der er fastsat i fig. 4. Endelig vil vi takke alle medlemmer af vores forskningslaboratorium for deres kommentarer, diskussioner og ubetydeligehts om dette arbejde.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Hank's Stock Solution #1 | 8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH2O | ||
Hank's Stock Solution #2 | 0.358 g Na2HPO4 anhydrous; 0.60 g K2H2PO4 in 100 ml ddH2O | ||
Hank's Stock Solution #4 | 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O | ||
Hank's Stock Solution #5 | 1.23 g MgSO4-7H2O in 50 ml ddH2O | ||
Hank's Premix | Combine in the following order: (1) 10.0 ml HS#1, (2) 1.0 ml HS#2, (3) 1.0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1.0 ml HS#5. Store all HS Solutions and Premix at 4 degrees Celcius. | ||
Hank's Stock Solution #6 | 0.35 g NaHCO3 in 10.0 mls ddH2O; make fresh on day of use. | ||
Hank's Final working solution | Combine 9.9 ml of Hank's Premix with 0.1 ml HS Stock #6 | ||
XX-Series UV Bench lamp | UVP | 95-0042-05 | Model XX-15S Bench Lamp |
XX Bench Stand (Adjustable) | UVP | 18-0062-01 | Model XX-15 Stand |
Embryo incubation dish | Falcon | 35-1005 | |
50 X E3 | 250 mM NaCl, 8.5 mM KCL, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water. Supplement with methylene blue (1 x 10-5 M) (Sigma M9140) to inhibit contamination. | ||
1 X E3 | Dilute 50 X E3 in distilled water | ||
Stereomicroscope | Nikon | SMZ645; SMZ1000 |