The zebrafish is a powerful model system for developmental biology and human disease research due to their genetic similarity with higher vertebrates. This protocol describes a methodology to create haploid zebrafish embryos that can be utilized for forward screen strategies to identify recessive mutations in genes essential for early embryogenesis.
Sebrafisk har blitt en mainstream virveldyr modell som er relevant for mange disipliner av vitenskapelige studier. Sebrafisk er spesielt godt egnet for videre genetisk analyse av utviklingsprosesser på grunn av deres ytre befruktning, embryonale størrelse, rask ontogeni, og optisk klarhet – en konstellasjon av egenskaper som gjør at den direkte observasjon av hendelser som strekker seg fra gastrulation til organogenesen med en grunnleggende stereomikroskop. Videre kan sebrafisk embryoer overleve i flere dager i det haploide tilstand. Produksjonen av haploide embryoer in vitro er et kraftig verktøy for mutasjonsanalyse, som det muliggjør identifisering av recessive mutant alleler stede i første generasjon (F1) kvinnelige bærere følgende mutagenese i foreldre (P) generasjon. Denne fremgangsmåten eliminerer nødvendigheten av å skaffe flere generasjoner (F2, F3, etc.) som innebærer avl av mutant-familier, og dermed sparer forskeren gang sammen med reduksjonsbehovene for sebrafisk koloni plass, arbeidskraft, og røkting og kostnader. Selv om sebrafisk har blitt brukt til å drive frem skjermer for de siste tiårene, har det vært en jevn utvidelse av transgene og genom redigeringsverktøy. Disse verktøyene tilbyr nå en mengde måter å lage nyanserte analyser for neste generasjon skjermer som kan brukes til å ytterligere dissekere genet regulatoriske nettverk som driver virveldyr ontogeni. Her beskriver vi hvordan du kan forberede haploide sebrafisk embryo. Denne protokollen kan implementeres for nye fremtidige haploide skjermer, slik som i Enhancer og suppressor skjermer, for å ta opp de mekanismene for utvikling for en bred rekke prosesser og vev som dannes under tidlige embryonale stadier.
De fundamentale prosesser som orkestrere virveldyr utvikling er grovt bevart en. En effektiv måte å identifisere gener med viktige roller i utviklingen er å isolere arve mutasjoner som fører til fenotypiske defekter i prosessen med interesse. Sebrafisk, Danio rerio, er en liten ferskvann teleost arter som tilhører cyprinidae fisk familien som har blitt en mye brukt modell organisme for virveldyr utviklings genetikk i løpet av de siste tiårene to. Sebrafisk egg er befruktet eksternt, tillater adgang til zygote fra utbruddet av befruktning tre. Videre er det tidlig embryo optisk transparent, slik at visualisering av utvikling med en enkel stereomikroskop 3. Sebrafisk ontogeni er rask, med prosesser av cleavage, gastrulation, og organogenesen av mange strukturer, slik som hjerte og nyre, i stor grad fullført i løpet av første dagen av utviklingen tre. Than tid fra larvestadiet til seksuell modenhet tar 2-3 måneder, og de voksne er små virveldyr ca 3-4 cm i lengde, kan så mange fisk opprettholdes på minimal plass to. I tillegg, sebrafisk voksne har høy fruktbarhet, hvor hver fisk i stand til å produsere flere hundre embryoer pr uke 2. Disse egenskapene har gjort det tractability av sebrafisk for forover og bakover genetiske skjermer. Sebrafisk har en høy grad av bevaring i sin anatomi, cellebiologi, og fysiologi med mer avanserte arter virveldyr som pattedyr 2,4. Faktisk har nylig sekvensanalyse viste at den sebrafisk genom inneholder homologer til nesten 70% av humane gener 5. Dette bevaring har aktivert forskerne å bruke sebrafisk som modell for mange menneskelige sykdommer, inkludert både embryonale og adulte forhold 2,4. Til sammen har disse faktorene gjorde sebrafisk et utmerket system for skjermer for å identifisere gener som erviktig for normal virveldyr ontogenetiske.
En rekke store skjermer har blitt utført i sebrafisk og har identifisert flere tusen mutasjoner i utviklings gener 6-8. Sebrafisk voksen hann er mottagelig for mutagenese, og kromosom endringer kan genereres med relativt høy frekvens ved hjelp av kjemisk mutagen ethylnitrosourea (ENU) 6,7 eller retroviral innsettingen mutagenese ni. Hittil har over 9000 arvelige mutasjoner blitt opprettet, og inkluderer gener som påvirker praktisk talt alle aspekter av embryogenesis. Sebrafisk samfunnet har etablert en sentralisert bank av disse mutanter på sebrafisk International Resource Center (eller zi) 10, som har samlet ca 5000 mutant og transgene alleler fra hele verden. Mange av disse mutasjonene er blitt analysert og klonet, gir forskere på tvers av biologiske disipliner verdifull informasjon som har blitt brukt til å erte hverandre numerooss cellulære og fysiologiske trasé gjennom innsikt stammer med sebrafisk eksperimenter.
Selv om termin skjermer har identifisert en imponerende rekke viktige gener, har mye ennå å bli verdsatt om de genetiske regulatoriske nettverk som formidler et mylder av prosesser. Mange skjermer gjennomført så langt har ikke nådd et metningspunkt, og dermed fremover samt revers genetiske skjermer har vært en hjørnestein for å identifisere og analysere mekanismene for embryogenesis. Mens det er enorm innsikt som kan være hentet fra en enkelt sebrafisk mutant linje, har en viktig begrensende faktor i feltet historisk vært tidkrevende arbeid involvert i posisjonell kloning. Av denne grunn har identiteten til mange kjemisk indusert mutasjoner forble et mysterium. Men, med den nylige ankomsten av hele genomsekvensering tilnærminger som letter rask kloning 11-14, er utrolig effektiv identifikasjon av genetiske mutasjoner nå feasible.
Den prototypiske frem skjermen i sebrafisk er en diploid skjerm som kan identifisere recessive mutasjoner innen tre generasjoner 6,7 (Figur 1, venstre kolonne). Denne teknikken innebærer genererer mutasjoner i kjønnsceller av foreldre (P) mann, og deretter parre denne hanne med en vill type kvinne. Hver av den første generasjon (F1) avkom fra denne paring vil huse et eller flere unike mutasjoner på grunn av de kromosomale bidragene fra de muterte fars genomet. F1-avkom er hevet og outcrossed med vill typer å skape F2 familier. I F2 familien, vil søsken være enten villtype eller heterozygote bærere, og er incrossed tilfeldig å generere F3 clutcher som er analysert for fenotype (r) av interesse. F3 klørne til heterozygote bærere vil inneholde 25% vill type, 50% heterozygote, og 25% homozygot mutant fisk. Denne multi-generasjons screening skjema er effektiv, men en stor ulempe til dette enpproach inkluderer tiden det tar å forberede seg på skjermen: minst ett år av fisk driften alene er involvert, siden hver generasjon krever rundt tre måneder å nå seksuell modenhet. Andre begrensninger av denne typen diploid skjermen er arbeidet, plass, og kostnadene for boliger disse generasjonene.
Den haploid skjermen er en alternativ som kan benyttes til å identifisere og deretter isolere recessive mutasjoner ved hjelp av lignende strategier mutagenese 15 (fig. 1, høyre kolonne). Produksjonen av haploide sebrafisk embryoer ble først beskrevet over 30 år siden 16, og evnen av den ordinære diploid sebrafisk til å utvikle flere dager med en haploid kromosomal ploiditet har vært benyttet for en rekke genetiske studier siden denne tid. Den store fordelen med den haploide skjermen er at denne metoden ikke innebærer å heve F2 familier for å screene for recessive mutante alleler. I stedet blir de F1 generasjon kvinner evaluert forheterozygositet av recessive mutasjoner i prosessen av interesse ved å undersøke deres F2-avkom på en haploid tilstand (fig. 1, høyre kolonne). Samlet, fremgangsmåten for å skaffe haploide embryoer er relativt grei (figur 2). Etter fremstilling av de nødvendige løsninger for spermier håndtering, blir eggene oppnådd fra F1 genererings hunner ved manuell manipulering, slik som å ekstrudere (eller "presse") eggene fra magen. Når eggene er oppnådd, blir de befruktet in vitro ved eksponering for ultrafiolett (UV) inaktivert sperm. Den UV-inaktivert spermier er ute av stand til å bidra levedyktig DNA til egg på grunn av det faktum at den korte bølgelengde UV-kryssbinder fars DNA. Men sædcellene er fortsatt i stand til å utløse egg aktivitet og hendelser assosiert med Zygotic utvikling. Ved metabolsk aktivering, vil egget full meiose II, og fortsette å utvikle seg med bare den ene mordyret deponert kopi av hver chromosomeg. På grunn av dette 1N ploidy, er fosteret utsatt for den utviklingsmessige konsekvensene av en recessiv mutant allel, hvis det er til stede på et mødre kromosom. Dermed hver F2 haploid clutch vil inneholde 50% villtype og 50% mutante embryoer dersom mor er en heterozygot bærer av et fullt penetrant recessivt allel. Denne fordeling av embryonale genotyper muliggjør relativ letthet når det gjelder å vurdere en clutch for nærvær av mutant fenotype (r) av interesse. Hvis det oppdages en slik fenotype, er F1-generasjonen kvinnelige gründer senere outcrossed til villtype male sebrafisk til å opprette og heve flere heterozygote bærere. Fordi det ikke er nødvendig å heve flere generasjoner til å utføre skjermen, kan forskeren spare mye tid, arbeid og akvarium plass, men fortsatt har makt til å kartlegge et betydelig antall genomer basert på antall F1 hunner undersøkt. Dermed haploide skjermer er spesielt gjennomførbart for små laboratorier eller prosjekter initiert i fravære av betydelige midler.
Det er imidlertid flere begrensninger og ulemper til bruk av haploids. Først haploide sebrafisk embryo lever for bare noen dager, og vanligvis dør mellom tre og fem dager etter befruktning (DPF) 15. Haploide sebrafisk embryo kan skilles fra diploider basert på flere egenskaper, fremst blant dem er en kort og tettvokst kropp som likevel har normalt antall somitt segmenter 15,17. Som utviklingen skrider frem, hjernen utstillinger økt celledød og sirkulasjon er dårlig, vanligvis assosiert med blod pooling av 2-3 dpf og ødem 15,17. Videre haploids ikke klarer å pumpe opp et svømmeblæren 15,17. Uavhengig av disse morfologiske forskjeller, er de fleste store organer og vev dannet, inkludert hjerte, øye og ryggstreng 15,17. En funksjon bemerket om haploide clutcher er at de inneholder en rekke fenotyper i form av varianter av defekte embryoer og #8212; en funksjon observert over sebrafisk stammer. Derfor bør man kontrollere hvis vevet (s) og tiden severdig vise rimelig normal utvikling i villtype haploid belastning og derfor har potensial til å bli vurdert for genetiske defekter i en skjerm eller et annet forskningsprosjekt.
Til tross for disse utfordringene, har haploide skjermer blitt gjennomført med hell for å identifisere gener som er nødvendige for tidlig utviklingsprosesser i sebrafisk, og haploide protokoller har blitt godt etablert ressurser i samfunnet i mange år 15-19. Flere nylig, har prosessen med å generere haploide fiske embryoer blitt brukt av forskere for å skape haploid embryonale stamceller (ES) cellekulturer fra medaka fisk 20,21. Etter fremstilling av medaka haploide embryoer in vitro, ble embryoene som brukes til å utlede primære cellekulturer som ble passaged i omtrent 15 uker, etterfulgt av ytterligere 5-8 uker for å generere rene kloner av haploide celler medES celleegenskaper 15-19. Den generasjonen av fisk haploide ES cellelinjer innehar bred tidig løftet for å analysere recessive fenotyper i virveldyr celle linjene, og representerer en ny tilnærming for genetiske analyser i de kommende årene. Dermed har den generasjonen av haploide fiskeembryoer voksende applikasjoner i biomedisinsk forskning samfunnet. Denne videoen artikkelen gir en visuell demonstrasjon av trinnene involvert med å produsere haploide sebrafisk embryo in vitro ved hjelp av UV-inaktivert sperm basert på etablerte protokoller 15-19,22.
Haploid screening er en nyttig teknikk for å oppdage viktige gener nødvendige for tidlige utviklingsstadier. Videre har dyrkning av haploide celler fra medaka fisken blitt brukt for å isolere ES-lignende cellelinjer som har tallrike forskningsapplikasjoner og potensial, noe som viser at haploide celler kan gi en verdifull tidig sted for andre typer av virveldyr genetiske studier 20,21. Denne protokollen gir en demonstrasjon av de metodene som er involvert med å utføre produksjonen av haploide sebrafisk embryo gjennom in vitro fertilisering med UV inaktivert sperm. Denne metoden kan benyttes til å utføre frem haploide skjermer med mutageniserte F1 fisk, noe som kan gjøres ved hjelp av villtype, transgene eller mutante stammer til enhancer / suppressor screening.
Selv om screening tid ved hjelp av en haploid strategi er vesentlig forkortet i forhold til diploid screening, vil det likevel ta flere måneder å fullføre. Som vi descriseng tidligere, er det mange fordeler som finnes ved å utføre en skjerm ved hjelp av en haploid skjema, som alle kan hjelpe til med å lage nye bidrag til den nåværende kunnskap om en rekke utviklingsmessige hendelser. Den haploid skjermen metoden er mer effektiv for identifisering av recessive mutante alleler enn diploide baserte skjermer på grunn av reduksjon av tid, plass, og antallet av fisk som er nødvendig. Imidlertid er det flere fallgruver til en haploid skjerm. En haploid skjermen kan kun identifisere mutanter i gener som er aktive i løpet av de første dagene av utvikling, som fosteret kan bare overleve for en begrenset tid med en haploid genom. Gener som uttrykkes senere utvikling ville trenge å bli identifisert ved en annen fremgangsmåte, for eksempel en diploid skjerm. Også er det noen organer ikke utvikle ordentlig i en haploid organisme. Det kan være anatomiske abnormiteter, eller et forsinket tidspunkt for utvikling, noe som kan føre til at mutasjonen å bli savnet av den haploide screening teknikk. Jegn tillegg trenger noen stammer av fisk ikke utvikle så vel i en haploid tilstand 15. Haploids kan kategoriseres ved en gradering rekke gode, middels og dårlige embryonale funksjoner, med et embryo som er den mest vanlige, B å utpeke embryoer med defekter i aksen, men et klart hode og hale, og C / D for å utpeke embryoer med ugjenkjennelig funksjoner (masser av celler oppå eggeplomme baller) 15,17. Andelene av embryoer innenfor disse kategoriene varierer fra sebrafisk belastning, med økt antall bedre kvalitet haploids mer utbredt i bestemte genetiske bakgrunn 15,17. På grunn av disse faktorer, er det nødvendig å finne en passende stamme av sebrafisk for å utføre mutagenese og påfølgende kors. I vår siste erfaring, den villtype Tübingen belastning produsert levedyktige haploids for screening (som vist i figur 3 og 4) om historisk sebrafisk forskere har benyttet AB eller AB * påkjenningen for haploid experimentering 15.
I tillegg til disse nevnte utfordringene, vil ikke alle primet voksen sebrafisk hunner produsere en clutch ved å utføre klemme teknikk. For eksempel, i samarbeide med NOR-mutageniserte Tübingen strekk hunner, omtrent halvparten av kvinnene gitt en clutch ved å klemme, og en fraksjon av disse (vanligvis 10-30%) var dårlig embryo kvalitet eller ikke kunne bli befruktet. Således, for å utføre en haploid skjerm må man har tenkt å innhente minst to ganger så mange fisk som er nødvendig for å screene det ønskede antall genomer (hvert dyr representerer en genomet vist). Uavhengig av denne betraktning, er fordelene ved den haploid metoden for screening for å dekke et stort antall genomer uten en massiv dyrefasilitet er faktisk ganske betydelig dersom analysen er mottagelig for det haploide tilstand. Imidlertid bør det også bemerkes at den videre undersøkelse av mutasjon (er) som er identifisert i haploide clutchen er fullstendig avhengige av lykkes med å heve enn utkrysning fra den kvinnelige gründer. Som med hvilken som helst skjerm, 'hits' i utgangspunktet identifisert i løpet av screening prosessen må re-identifisert i diploid tilstand.
Til tross for de fallgruvene ved bruk av haploid skjermen, har det vist seg å være svært vellykket i å identifisere mutanter, som er blitt analysert i dybden med innsiktsfulle gevinster til det vitenskapelige felt 15. Haploide skjermer kan iverksettes for å undersøke andre dårlig forstått prosesser av virveldyr utvikling. Bruke haploids for Enhancer og suppressor skjermer er én måte å få mer innsikt i aktivitetene og regulatoriske nettverk av et gen av interesse. Den haploid screeningteknikk kan også brukes til å identifisere forsterkere og undertrykkere av mutanter som allerede er blitt isolert ved fremgangsmåter som for eksempel kjemisk eller innsettingen mutagenese eller revers genetikk tilnærminger som tilling eller Talens. Kort sagt, kan den tidligere isolerte mutant bli mutagenisert med ENU og skjermet for Forsterker eller suppressors av den opprinnelige mutant fenotype. Mutanten må være i stand til å nå adulte stadier, slik at det er nødvendig å ha en heterozygote dyr eller en svak homozygot mutant fisken for å utføre denne skjerm, men nylige fremskritt i transgenesis har tillatt forskere å skjørt dette problemet. Lære å manipulere veier i utviklingen kan føre til mange spennende muligheter, inkludert utsiktene til perturbasjonsinnretningen trasé å behandle sykdomstilstander.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av midler til RAW fra følgende: NIH tilskudd K01 DK083512, DP2 OD008470, og R01 DK100237; March of Dimes Basil O'Connor Starter Scholar Award # 5-FY12-75; starte opp midler fra University of Notre Dame College of Science and Department of Biological Sciences; og en sjenerøs gave til University of Notre Dame fra Elizabeth og Michael Gallagher på vegne av Gallagher Family å fremme stamcelleforskning. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Vi takker staber av Department of Biological Sciences for deres støtte, og Center for sebrafisk Forskning ved Notre Dame for sin enestående engasjement i omsorg og velferd for våre sebrafisk koloni. Vi takker GF Gerlach for å ta bilder som er gitt i Figur 4.. Slutt, vi takker alle medlemmer av vår forskningslaboratorium for sine kommentarer, diskusjoner og Insights om dette arbeidet.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Hank's Stock Solution #1 | 8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH2O | ||
Hank's Stock Solution #2 | 0.358 g Na2HPO4 anhydrous; 0.60 g K2H2PO4 in 100 ml ddH2O | ||
Hank's Stock Solution #4 | 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O | ||
Hank's Stock Solution #5 | 1.23 g MgSO4-7H2O in 50 ml ddH2O | ||
Hank's Premix | Combine in the following order: (1) 10.0 ml HS#1, (2) 1.0 ml HS#2, (3) 1.0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1.0 ml HS#5. Store all HS Solutions and Premix at 4 degrees Celcius. | ||
Hank's Stock Solution #6 | 0.35 g NaHCO3 in 10.0 mls ddH2O; make fresh on day of use. | ||
Hank's Final working solution | Combine 9.9 ml of Hank's Premix with 0.1 ml HS Stock #6 | ||
XX-Series UV Bench lamp | UVP | 95-0042-05 | Model XX-15S Bench Lamp |
XX Bench Stand (Adjustable) | UVP | 18-0062-01 | Model XX-15 Stand |
Embryo incubation dish | Falcon | 35-1005 | |
50 X E3 | 250 mM NaCl, 8.5 mM KCL, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water. Supplement with methylene blue (1 x 10-5 M) (Sigma M9140) to inhibit contamination. | ||
1 X E3 | Dilute 50 X E3 in distilled water | ||
Stereomicroscope | Nikon | SMZ645; SMZ1000 |