Tobakksplanter ble brukt til å produsere en fungal cellulase, TrCel5A, via et transient ekspresjonssystem. Uttrykket kan bli overvåket ved hjelp av en fluoriserende fusjonsprotein, og proteinaktiviteten ble karakterisert etter ekspresjon.
Cellulose nedbrytende enzymer, cellulaser, er mål for både forskning og industrielle interesser. Det meste av disse enzymene i vanskelige til-kultur organismer, slik som hyfer byggende fungi og anaerobe bakterier, har påskyndet ved bruk av rekombinant teknologi på dette området. Plant expression metoder er en ønskelig system for storskala produksjon av enzymer og andre industrielt nyttige proteiner. Heri er metoder for transient ekspresjon av en sopp-endoglucanase, Trichoderma reesei Cel5A, i Nicotiana tabacum demonstrert. Vellykket protein uttrykk vises, overvåket av fluorescens ved hjelp av en mCherry-enzym fusjonsprotein. I tillegg er et sett grunntester brukt til å undersøke aktiviteten til forbigående uttrykt T. reesei Cel5A, inklusive SDS-PAGE, Western blotting, zymography, så vel som fluorescens-og fargestoffbaserte substrat degradering analyser. Systemet som er beskrevet her kan brukes til å frembringe en aktiv celleulase i en kort tidsperiode, slik som å vurdere potensialet for videre produksjon i planter gjennom konstitutive eller induserbare ekspresjonssystemer.
Nedbrytning av lignocellulose biomasse og dens konvertering til flytende drivstoff har blitt tenkt som en metode for å redusere avhengigheten av fossilt brensel. En vesentlig hinder i å etablere økonomisk gjennomfør biomasse behandlingssystemer er i enzymatisk nedbrytning av cellulose og hemicellulose en. Plant ekspresjonssystemer viser et stort potensial for produksjon av enzymer i en industriell skala. Landbruk systemer til slakteanlegg økonomisk og i volum er allerede etablert, som de har vært i tusenvis av år. Produksjonen av cellulaser i planter er ønskelig på grunn av faktorer som den enkle autohydrolysis 2, og potensialet for å maksimere bruken av lavere enzymnivåer ved å øke fordøyeligheten av plante-cellevegger en. Til slutt, plante-systemer tillater målretting av rekombinante proteiner i bestemte områder av planteceller og er i stand til å posttranslationally endre enzymer der kreves tre.
ve_content ">Nicotiana tabacum (tobakk) er svært ofte brukt som modellorganisme for heterologe protein expression studier i planter, på grunn av sin raske vekst og biomasse akkumulering funksjoner fire. Transient ekspresjon av rekombinante proteiner er en teknikk som gjør det proteinproduksjon i korte tidsperioder 5, og samtidig opprettholde fleksibilitet med hensyn til lokalisering og dermed posttranslational modifikasjoner av de utvalgte proteiner, dvs. cellulaser. Dette muliggjør produksjon av en cellulase (r) for grunnleggende analyse, og samtidig legge forholdene til rette for ytterligere uttrykk strategier i planter. Ved hjelp av en slik forbigående uttrykk strategi, er en endoglucanase fra glycosyl hydrolase familien 5, Cel5A, avledet fra soppens verten Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina) 6 produsert (heretter kalt TrCel5A). TrCel5A er et 42 kDa protein som er nativt glykosylert og er svært aktive i hydroylzing cellulosekjedene 7.
Den forbigående ekspresjon teknikk som er beskrevet her er basert på en forholdsvis vanlig brukt system, infiltrere anlegget blader med Agrobacteria bærer genet av interesse i en passende ekspresjonsvektor. For å muliggjøre rask analyse av vellykket i planta uttrykk, kan TrCel5A også uttrykkes som et fusjonsprotein med mCherry, en monomerisk fluorescerende protein opprinnelig stammer fra Discosoma sp. Protein DsRed 8, med ytterligere seks histidin rester (Hans-tag) smeltet til C-terminalen (TrCel5A-mCherry). Ekspresjon av det heterologe fusjonsproteinet, TrCel5A-mCherry, kan således bli overvåket i løpet av den voksende planten ved hjelp av grønt lys for å undersøke mCherry spredning. Hvis ønskelig, kan tynne snitt av plantematerialet bli undersøkt under grønt lys mikroskopisk for å etablere den spesifikke lokaliseringen av proteinet. For dette arbeidet, signal og transitte peptider ble innlemmet i konstruksjonen, for å lokalisere den heterologe protein eksport til det endoplasmatiske retikulum ni.
For å analysere aktiviteten av plante uttrykt cellulaser, inkludert TrCel5A, en rekke cellulase aktivitetstester kan kjøres. Etter ekstraksjon av den totale oppløselige planteproteiner, kan TrCel5A bli delvis renset ved anvendelse av en termisk inkubasjon teknikk. Protein størrelse er etablert ved hjelp av SDS-PAGE etterfulgt av Western blotting. Zymography kan brukes til å analysere aktivitet mot substrater, f.eks cellulose som har vært karboksy-metylert (gjør karboksymetylcellulose: CMC) for oppløseligheten 10. Cellulase, og glukosidase-aktivitet kan overvåkes ved hjelp av fluoroforen 4-methylumbelliferyl (4-MU) forbundet med β-D-cellobioside (kombinert: 4-AMS). En annen metode for å vurdere endoglucanase aktivitet involverer spektrometrisk analyse av CMC som er blitt forbundet med en azo-dye (Remazolbrilliant Blå R) 11. I tillegg kan protein-aktivitet av både endoglucanases og en rekke cellulaser overvåkes ved bruk av en sukkeranalyse test, som for eksempel p-hydroksy benzosyre-hydrazid (PAHBAH) assay 12.. Disse teknikker kan brukes til å belyse og kvantifisering av aktiviteten til uttrykt cellulase av interesse.
Rekombinant ekspresjon av cellulaser er et felt av stor interesse, på grunn av ønsket om mer effektive biobrensel produksjonssystemer en. Planter gir mange muligheter for vellykket cellulase produksjon, med funksjoner som økonomisk høsting teknikker og autohydrolysis metoder blir svært ønskelige egenskaper for storskala produksjon av biodrivstoff. Videre, bruk av forskjellige lokaliseringer for å produsere proteiner som tillater, hvis nødvendig, posttranslational modifikasjoner 20. Endre pl…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av BMBF Forschungsinitiative "Bioenergie 2021 – Forschung für die Nützung von biomasse" og Cluster of Excellence "Skreddersydde Fuels fra biomasse", som er finansiert gjennom Excellence Initiative av den tyske føderale og statlige myndigheter for å fremme vitenskap og forskning ved tyske universiteter.
4-methylumbelliferyl β-D-cellobioside | SIGMA-ALDRICH | M6018 | |
Acetic acid | ROTH | 3738 | |
Acetosyringon (concentrated) | ROTH | 6003 | |
Antibiotic – kanamycin | ROTH | T832 | |
Antibiotic – rifampicin | ROTH | 4163 | |
Antibiotic – carbenicillin | ROTH | 6344 | |
Antibody – rabbit anti His(6) pAb | ROCKLAND | 600-401-382 | |
Antibody – goat anti rabbit AP, FC pAb | DIANOVA | 111-055-008 | |
Azo-carboxymethyl cellulose | MEGAZYME | S-ACMC | |
β-cyclodextrin | SIGMA-ALDRICH | C4805 | |
Calcium chloride dihydrate | SIGMA-ALDRICH | C5080 | |
Carboxymethyl cellulose | ROTH | 3333.1 | |
Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921 | SIGMA-ALDRICH | C2730 | |
Congo red | SIGMA-ALDRICH | 75768 | |
Coomasie brilliant blue G 250 | ROTH | 9598.2 | |
D(+)-glucose | ROTH | 8337 | |
Ethanol | ROTH | K928 | |
Filter paper – Rotilabo blotting paper | ROTH | CL67 | |
NBT/BCIP | SIGMA-ALDRICH | 72091 | |
MES buffer | ROTH | 4256 | |
Methanol | ROTH | 8388 | |
Sodium citrate | ROTH | 3580 | |
Sodium dodecylsulfate | SERVA | 20765 | |
Sodium hydroxide | ROTH | 6771 | |
Soil, Einheitserde classic | PATZER GMBH | ||
Spectrometer – Infinite M200 | TECAN | ||
Sucrose | SIGMA-ALDRICH | S-5390 | |
4-Hydroxy benzhydrazide | SIGMA-ALDRICH | H9882 | |
Phosphate buffered saline | ROTH | 1058 | |
UV light source – BLAK RAY | UVP | ||
Vibratome – VT1000S | Leica |