An approach is presented for determining structures of viral membrane glycoprotein complexes using a combination of electron cryo-tomography and sub-tomogram averaging with the computational package Jsubtomo.
Kappekledde virus utnytte membran glykoproteiner på overflaten å megle innreise til vertsceller. Tredimensjonal strukturell analyse av disse glykoprotein "pigger" er ofte teknisk utfordrende, men viktig for å forstå viral patogenese og i drug design. Her er en protokoll som presenteres for virale spike strukturbestemmelse gjennom beregnings snitt av elektron kryo-tomografi data. Electron cryo-tomografi er en teknikk i elektronmikroskopi brukes til å utlede tredimensjonale tomografiske volum rekonstruksjoner, eller tomograms, av pleomorphic biologiske prøver som membran virus i en tilnærmet opprinnelig, frossen-hydrert tilstand. Disse tomograms avdekke strukturer av interesse i tre dimensjoner, om enn på lav oppløsning. Beregnings midling av sub-volumer, eller under tomograms, er nødvendig for å oppnå høyere oppløsning detalj av gjentagende strukturelle motiver, slik som viral glykoprotein pigger. En detaljert beregnings tilnærming for aligning og snitt under tomograms bruker Jsubtomo programvarepakke er skissert. Denne tilnærmingen muliggjør visualisering av strukturen av viral glykoprotein pigger til en oppløsning i størrelsesorden 20-40 Å, og studiet av studiet av høyere ordens topp-til-topp vekselvirkninger på virusmembranen. Typiske resultater presenteres for Bunyamwera virus, en kappekledte viruset fra familien Bunyaviridae. Denne familien er et strukturelt sammensatt gruppe av patogener som truer menneskers og dyrs helse.
Elektron kryo-tomografi er et elektron-mikroskopi kryo avbildningsteknikk som tillater beregning av en tre-dimensjonal (3D) rekonstruksjon av komplekse biologiske prøver. Egnede prøver spenner fra rene makromolekylære komplekser 1, filamenter 2, belagt vesikler 3 og pleomorphic membran virus fire til hele prokaryote celler 5 og selv tynne områder av hele eukaryote celler seks. Etter datainnsamlingen av en tilt-serien, 3D tomografiske volumer, eller tomograms, kan beregnes ved hjelp av flere etablerte programvarepakker, inkludert Bsoft 7 og imod åtte.
To aspekter forbundet med den for undersøkelse av biologiske prøver ved elektron kryo-tomografi grense den biologiske tolkning av de tilsvarende tomografiske volumer. Først, på grunn av den begrensede elektron dose som kan anvendes på biologiske materialer før innføring betydelig stråleskader, signal-til-støy-forhold i tomografiske data er vanligvis meget lav. For det andre, som et resultat av begrenset prøve tilt geometri under datainnsamlingen, noen utsikt av objektet være fraværende, noe som fører til en såkalt "missing kilen artefakt på tomografisk volum. Imidlertid kan begge disse begrensninger kan overvinnes hvis tomografisk volumet inneholder gjentatte, identiske strukturer, slik som makromolekylære komplekser, som kan være vellykket i gjennomsnitt 9-12.
Før gjennomsnitt strukturer fra tomogram rekonstruksjoner, må gjenstander av interesse bli funnet og justert til samme retning. Lokalisering av sådanne strukturer kan oppnås ved kryss-korrelasjon av en mal struktur i tomografisk volum ved bruk av en tilnærming ofte referert til som sjablon som passer 13. Malen som brukes i denne matchende prosessen kan være avledet fra elektronmikroskopi eller cryo-elektron kryo-tomografi i kombinasjon med 3D-rekonstruksjon, eller det kan være en tetthet fra kart simulertet atom-strukturen. Flere beregnings pakker har blitt utviklet for å utføre disse oppgavene 11.
Midling av glykoprotein pigger av membran virus, slik som HIV-1, har vært spesielt vellykket tilnærming for å studere deres struktur 14-16. En forståelse av strukturen er integrert for å avsløre både det molekylære grunnlaget for virus-vert interaksjoner og guiding viral og vaksine designutvikling. Mens makromolekylær krystallografi er teknikken med valg for høy oppløsning (vanligvis bedre enn 4 a) strukturanalyse av individuelle virale glykoproteiner og deres komplekser, røntgenstrukturer som følge av denne fremgangsmåte er av proteiner isolert fra det naturlige miljø membranøs på virus . Således viktige detaljer som høyere ordens arkitektur av virale glykoproteiner, i sammenheng med den virion, forblir mangler. På den annen side, kryo-elektronmikroskopi og enkelt partikkel rekonstruksjonav hele kappekledde virus er begrenset til virioner med icosahedral symmetri 17,18. Electron cryotomography kombinert med sub-volum justering har dermed dukket opp som en komplementær teknikk slik at studiet av glykoprotein pigger av uvanlig fasong, pleomorphic virus i situ.
Vi har utviklet programvare kalt Jsubtomo (www.opic.ox.ac.uk/jsubtomo) for deteksjon, justering og gjennomsnitt av tomografiske under volumer. Jsubtomo har blitt benyttet i strukturbestemmelse av et antall cellulære og virale strukturer 19-26. Her skisserer vi en detaljert protokoll som muliggjør fastsettelse viral-overflate pigg strukturer. For å omgå over-foredling av gjennomsnitts strukturer ved å korrelere støy, er "gull-standard" raffinement ordningen vedtatt 10,27. Endelig er strategier for visualisering og tolkning av typiske resultater diskutert.
Kjennskap til viral glykoprotein pigg struktur på virusmembranen er avgjørende for forståelsen av virusreplikasjon, og å utvikle terapeutiske midler for å behandle og forebygge infeksjoner. Elektron kryo-mikroskopi i kombinasjon med enkelt partikkel i snitt har dukket opp som de mest brukt metode for å løse strukturer av omhyllede virus partikler, inkludert glykoproteinet pigger. Imidlertid er denne fremgangsmåte begrenset til icosahedrally symmetriske virus. Her, gjennom anvendelse av elektron cryo-tomografi og subtomogram snitt i Jsubtomo, har vi skissert en generell protokoll for å bestemme glykoprotein spikes på pleomorphic kappekledde virus som ikke er mottagelig for andre aktuelle strukturelle biologiske metoder. Våre representative resultatene viser at oppløsningen på denne metoden er tilstrekkelig til å avsløre innsikt i domene arkitektur, oligomerisering, og høyere orden organisering av glykoprotein pigger på intakte virioner.
jove_content "> Den mest kritiske trinn i denne protokollen er å konstruere to pålitelige utgangsmodeller som er statistisk uavhengige av hverandre. Vellykket utførelse av dette trinn går ut på at glykoprotein pigger er tilstrekkelig stor og ikke pakket mot hverandre for tett, slik at de enkelte pigger kan være visuelt gjenkjent og manuelt tatt i tomograms, og to uavhengige modeller i gjennomsnitt. Hvis dette ikke er mulig, to modifikasjoner av protokollen kan bli forsøkt. første to uavhengige tilfeldige modeller kan konstrueres ved først å definere to tilfeldige undergrupper av subtomograms og deretter ta gjennomsnittet av de subtomograms innenfor disse undergrupper 30. andre, hvis en struktur av den isolerte pigg har blitt utledet på annen måte, for eksempel ved røntgenkrystallografi, kan den brukes som et utgangsmodell. Imidlertid må det utvises forsiktighet for å stillegå- pass filter denne modellen ved hjelp av en lav oppløsning cut-off (50-70 Å), som de to resulterende modeller i neste runde av raffinement vilvære statistisk uavhengige bare utover denne oppløsningen. På grunn av denne forbeholdet, blir den tidligere tilnærming anbefalt.Oppnåelig oppløsning fra denne protokollen avhenger av fire viktige faktorer: i. datainnsamling formasjonen, og kvaliteten av inngangsdata, ii. antall av subtomograms, iii. justeringsnøyaktighet av de subtomograms, og iv. heterogenitet av strukturene. Mens den første og andre begrensninger i stor utstrekning kan overvinnes ved å bruke høye signal-til-støy direkte elektron detektorer kombinert med CTF korrigert tomografi og automatisert innsamling av data, blir justeringsnøyaktighet ytterligere påvirkes av størrelsen og formen på strukturen av interesse i seg selv. Ved anvendelse av denne protokollen på små pigger mangler fremtredende egenskaper, kan det være fordelaktig å binde til Fab fragmenter piggen for å forbedre justeringsnøyaktighet og dermed oppløsning 31. Til slutt, hvis strukturer som skal gjennomsnitt oppviser flere konformasjoner, sub-tomogram klassifiseringsmetoder kan benyttes til gjennomsnittlig forskjellige konformasjoner separat. For å nå dette målet, integrerer Jsubtomo med Dynamo-pakken som gir kraftig subtomogram klassifisering ni.
Den ovennevnte protokoll er komplementær til røntgen-krystallografi av isolerte virale glykoproteiner. Krystallografiske strukturer kan monteres inn i sub-tomogram gjennomsnitt for å oppnå en nøyaktig orientering av glykoproteinet med hensyn til virusmembranen. Anvendelse av denne metodikken vil utvilsomt fortsette å kaste lys på innhyllet virus struktur og patobiologi.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Academy of Finland (130750 and 218080 to J.T.H.), the Wellcome Trust (090532/Z/09/Z; 089026/Z/09/Z to T.A.B.), and by the MRC (MR/J007897/1 to J.T.H and T.A.B; MR/L009528/1 to T.A.B.).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Jsubtomo (ver 1.3.1) | University of Oxford | n/a | www.opic.ac.uk/jsubtomo |
Bsoft (ver 1.8.7) | NIAMS, NIH | n/a | bsoft.ws |
UCSF Chimera | UCSF | n/a | www.cgl.ucsf.edu/chimera |