In vitro Bukspottkörteln Organogenesis från spridda Mouse Embryonala stamfäder

Summary

Den tredimensionella kultur metod som beskrivs i detta protokoll rekapitulerar bukspottkörteln utveckling från spridda embryonala mus bukspottkörteln progenitorceller, inklusive deras betydande expansion, differentiering och morfogenes i ett grenat orgel. Denna metod är mottaglig för bildbehandling, funktionella störningar och manipulation av nisch.

Abstract

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the development of protocols to produce pancreatic cells from stem cells ¹. The whole embryonic organ can be cultured at multiple stages of development ^2-4. These culture methods have been useful to test drugs and to image developmental processes. However the expansion of the organ is very limited and morphogenesis is not faithfully recapitulated since the organ flattens.

We propose three-dimensional (3D) culture conditions that enable the efficient expansion of dissociated mouse embryonic pancreatic progenitors. By manipulating the composition of the culture medium it is possible to generate either hollow spheres, mainly composed of pancreatic progenitors expanding in their initial state, or, complex organoids which progress to more mature expanding progenitors and differentiate into endocrine, acinar and ductal cells and which spontaneously self-organize to resemble the embryonic pancreas.

We show here that the in vitro process recapitulates many aspects of natural pancreas development. This culture system is suitable to investigate how cells cooperate to form an organ by reducing its initial complexity to few progenitors. It is a model that reproduces the 3D architecture of the pancreas and that is therefore useful to study morphogenesis, including polarization of epithelial structures and branching. It is also appropriate to assess the response to mechanical cues of the niche such as stiffness and the effects on cell´s tensegrity.

Introduction

Organkultur ger en användbar modell som överbryggar klyftorna mellan den komplexa men mycket relevant in vivo-undersökningar och bekvämt men ungefärlig simulering av cellinje modeller. I fallet med bukspottkörteln, det inte finns någon cell linje perfekt motsvarar pankreas progenitorer även om det är transformerade cellinjer som simulerar endokrina och exokrina celler. Den vuxna Hela bukspottkörteln kan inte odlas; isolerade endokrina cellöar kan upprätthållas under några få veckor, utan att celltillväxt och vävnadsskivor kan hållas in vitro under några timmar ^5. Embryonala bukspottkörteln kultur har använts i stor utsträckning inte bara för att studera dess utveckling, men också för att undersöka epitelceller-mesenkymala interaktioner ^4,6,7, att bilden processer ⁸ eller kemiskt störa dem ^9. Två organodlingsmetoder används främst: den första består i att odla pankreas knoppar på fibronektin belagda plattor ^2, vilket är convenient för avbildningsändamål; det andra alternativet är att odla organ på filter på luft-vätske-gränssnittet ^3,4 som bäst bevarar morfogenes. Även mycket användbara, är dessa metoder leder till en viss grad av tillplattning; expansionen av progenitorceller är mycket begränsad i jämförelse med den normala utvecklingen och utgångspopulationen är komplex innefattande alla typer av pankreatiska celler och mesenkymala celler.

Förmågan att kulturen och expandera spridda primära celler är värdefullt att studera härstamning relationer och avslöja de inneboende egenskaper isolerade celltyper ^10. Sugiyama m.fl. ^11. Skulle kunna behålla pankreas stamceller och endokrina stamfäder som behållit vissa funktionella tecken i 3-5 dagar i kultur på matarskikt. Pancreatospheres, besläktad med neurosfärer ¹² och mammospheres ^13, har utökats från vuxna cellöar och duktala celler även om vilken typ av progenitorer / stamcellersom genererar dessa sfärer är inte klart. Dessutom, i motsats till fysiologisk utveckling innehöll pancreatospheres vissa nervceller ^14,15. Klot har också nyligen producerat från embryonala pankreasgångare ^16,17 och regenere pancreata ¹⁸ med god stamfader expansion och efterföljande differentiering men misslyckades med att rekapitulera morfogenes.

3D-modeller från spridda och ofta definierade celler som själv organiserar i miniatyriserade organ har nyligen blomstrade och simulera utvecklingen eller en vuxen omsättning på flera organ såsom tarm ^19,20, magen ^21, lever ^22, prostata ²³ och luftstrupen ^24. I vissa fall har utvecklings morfogenes och differentiering valts rekapituleras i 3D från ES-celler, såsom är fallet med optiska kopparna ^25, tarmen ²⁶ eller hjärn ^27.

Här, vi desCribe en metod att expandera dissocierade multi pankreas stamceller i en 3D Matrigel byggnadsställning där de kan differentiera och självorganisation.

Protocol

Detta protokoll ska växa pankreas organoids härrör från mus-E10.5 dissocierade epithelial celler i bukspottkörteln. Protokollet kräver etiskt godkännande för djurförsök. 1. Dissektion av Dorsal bukspottskörteln Bud från E10.5 musembryon Offra tidsinställd-dräktiga möss på embryonala dag (E) 10.5, öppna buken med en sax, ta bort de två livmoderhornen och placera dem i en 10 cm petriskål fylld med kall fosfatbuffert saltlösning (PBS) …

Representative Results

E10.5 dorsala bukspottskörteln stamceller dissocierade och heat i 3D Matrigel rekapitulera bukspottkörteln utveckling. Stamceller kan enklast följas med fluorescerande reportrar. I vårt fall använde vi en transgen mus som uttrycker en nukleär GFP protein styrs av Pdx1 promotor (Pdx1-Ngn3-ER TM-nGFP) (film 1) i avsaknad av tamoxifen och därmed utan att aktivera Neurog3 4 (figur 2). Med organoid medium, en första packning av små…

Discussion

Storskalig produktion av funktionella betaceller in vitro är fortfarande ineffektivt ^1. I detta utmanande sammanhang, kan utvecklingsbiologiska studier hjälpa dechiffrera de exakta signaler som krävs för differentiering av funktionella betaceller. Detta protokoll möjliggör för underhåll, utbyggnad och differentiering av embryonala pankreas stamceller in vitro. Detta omfattar bildandet av insulinproducerande betaceller som inte samar uttrycka andra endokrina hormoner, har höga nivåe…

Materials

Penicillin-Streptomycin	Gibco	15070-063	Stock keept at -20°C
KnockOut Serum replacement (supplement)	Gibco	10828-028	Stock keept at -20°C
2-mercaptoethanol	Sigma Aldrich	3148-25ML	Stock keept at 4°C
Phorbol Myristate Acetate (PMA)	Calbiotech	524400-1MG	Stock keept at -20°C
Y-27632 (ROCK inhibitor)	Sigma Aldrich	ab120129	Stock keept at -20°C- Attention! Stability/source is a frequent source of problems
EGF	Sigma Aldrich	E9644-2MG	Stock keept at -80°C
Recombinant Human R-spondin 1	R&D	4645-RS-025/CF	Stock keept at -80°C
- or -
Recombinant Mouse R-spondin 1	R&D	3474-RS-050	Stock keept at -80°C
Recombinant Human FGF1 (aFGF)	R&D	232-FA-025	Stock keept at -80°C- do not include to increase beta cell production
Heparin (Liquemin)	Drossapharm		Stock keept at 4°C
Recombinant Human FGF10	R&D	345-FG-025	Stock keept at -80°C
DMEM/F-12	Gibco	21331-020
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15070-063	Stock keept at -20°C
B27 x50 (supplement)	Gibco	17504-044	Stock keept at -20°C
Recombinant Human FGF2 (bFGF)	R&D	233-FB-025	Stock keept at -80°C
Y-27632 (ROCK inhibitor)	Sigma Aldrich	ab120129	Stock keept at -20°C- Attention! Stability/source is a frequent source of problems
DMEM/F-12	Gibco	21331-020
Matrigel	Corning	356231	Stock keept at -20°C
Trypsin 0.05%	Gibco	25300-054	Stock keept at 4°C
RNAlater – RNA stabilizing reagent	Qiagen	76104	Store at room temperature
Dispase	Sigma Aldrich	D4818-2MG	Stock keept at -20°C
BSA for reconstitution	Milipore	81-068	For reconstituition of cytokines  – Stock keept at -20°C
Fetal calf serum (FCS)	Gibco	16141079	Stock keept at -20°C
60 well MicroWell trays	Sigma Aldrich	M0815-100EA
4-well plates	Thermo Scientific	176740
95-well plates F bottom	Greiner Bio	6555180
Glas bottom plates	Ibidi	81158
Disposal micropittes	Blaubrand	708745