Mouse embryonic fibroblast can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells at low efficiency by the forced expression of transcription factors Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc. The rare intermediates of the reprogramming reaction are FACS isolated via labeling with antibodies against cell surface makers Thy-1.2, Ssea-1, and Epcam.
Mature cells can be reprogrammed to a pluripotent state. These so called induced pluripotent stem (iPS) cells are able to give rise to all cell types of the body and consequently have vast potential for regenerative medicine applications. Traditionally iPS cells are generated by viral introduction of transcription factors Oct-4, Klf-4, Sox-2, and c-Myc (OKSM) into fibroblasts. However, reprogramming is an inefficient process with only 0.1-1% of cells reverting towards a pluripotent state, making it difficult to study the reprogramming mechanism. A proven methodology that has allowed the study of the reprogramming process is to separate the rare intermediates of the reaction from the refractory bulk population. In the case of mouse embryonic fibroblasts (MEFs), we and others have previously shown that reprogramming cells undergo a distinct series of changes in the expression profile of cell surface markers which can be used for the separation of these cells. During the early stages of OKSM expression successfully reprogramming cells lose fibroblast identity marker Thy-1.2 and up-regulate pluripotency associated marker Ssea-1. The final transition of a subset of Ssea-1 positive cells towards the pluripotent state is marked by the expression of Epcam during the late stages of reprogramming. Here we provide a detailed description of the methodology used to isolate reprogramming intermediates from cultures of reprogramming MEFs. In order to increase experimental reproducibility we use a reprogrammable mouse strain that has been engineered to express a transcriptional transactivator (m2rtTA) under control of the Rosa26 locus and OKSM under control of a doxycycline responsive promoter. Cells isolated from these mice are isogenic and express OKSM homogenously upon addition of doxycycline. We describe in detail the establishment of the reprogrammable mice, the derivation of MEFs, and the subsequent isolation of intermediates during reprogramming into iPS cells via fluorescent activated cells sorting (FACS).
Embryonala stamceller (ES-celler) är härledda från den inre cellmassan av embryon blastocyststadiet 1. Under lämpliga odlingsbetingelser som de själv förnya och förblir pluripotenta. Under 2006 Yamanaka och kollegor visade att mogna celler kan omprogrammeras till så kallade inducerade pluripotenta stamceller (iPS-celler) genom forcerad uttryck av transkriptionsfaktorer oktober-4, Klf-4, Sox-2, c-Myc (OKSM) 2. iPS-celler, som ES-celler, kan ge upphov till alla celltyper i kroppen, men de är fria från de etiska restriktioner omger generering av ES-celler 3. Dessutom iPS-celler bär ett löfte om personlig regenerativ medicin och håll en enorm potential för tillämpningar som sjukdomsmodeller och in vitro drog screening 4,5. För att programmera om teknik för att uppfylla denna potential behöver den grundläggande mekanismen av kärn omprogrammering till fullo förstås. Men ansträngningarna dissekera omprogrammering patHway har hindrats av det faktum att endast ett mycket litet antal celler omprogrammera (0,1-1%). Framgångsrikt omprogrammering fibroblaster har rapporterats att genomgå en distinkt serie händelser, inklusive en mesenkymala till epiteliala övergång 6-10, och i slutskedet av omprogrammering, aktivering av endogena kärn pluripotens nätet 11-14. Vi och andra 12,13,15-17 har nyligen identifierat en uppsättning cellytemarkörer som möjliggör separation av sällsynta mellan från eldfasta bulk befolkningen. Omprogrammering mus embryonala fibroblaster (MEF) genomgår förändringar i uttryck av Thy-1.2, Ssea1 och EpCAM (bland andra) under 2 veckor långa omprogrammering process 15. Tidigt under omprogrammering en delmängd av MEF nedreglera uttrycket av fibroblast identitetsmarkör (Thy-1.2) och sedan börja uttrycka pluripotens relaterade markör SSEA-1 12. Under slutskedet av omprogrammering Ssea1-positiva celler reaktivåt endogena pluripotens gener såsom oktober-4 10-13,15. Denna sista övergång markeras på cellytan genom påvisbar uttryck av EpCAM (se figur 1) eller i ett senare skede PECAM 15. Nyligen O'Malley et al. Rapporterade användningen av CD44 och iCAM1 som alternativ eller komplement till Thy-1.2 och SSEA-1 för identifiering av omprogrammering intermediärer. Vi har tidigare FACS extraherade omprogrammering intermediärer från dag 0, dag 3, Dag 6, Dag 9 och dag 12 omprogrammering kulturer samt från etablerade iPS cellinjer utifrån dessa cellytemarkörer 15,18. För nedan beskrivna omprogrammering systemet och villkor har vi visat på enskild cellnivå att även populationerna är tyst homogena, det finns en viss grad av heterogenitet i de identifierade mellanliggande populationer. Det bör noteras att endast en delmängd av celler inom dessa populationer kan gå vidare till respektive nästa staGE av omprogrammering processen och ger upphov till iPS cellkolonier vid olika verkningsgrader, som har varit föremål för omfattande karakteriseras tidigare 15,19. Dessutom kommer omprogrammering effektiviteten i dessa populationer beror såväl på de åter plating och odlingsbetingelser. För att öka experimentella reproducerbarhet använder vi en omprogrammerbar musstam som har utvecklats för att uttrycka en transkriptionstrans (m2rtTA) under kontroll av ROSA26 lokus och en polycistroniskt OKSM kassett under kontroll av en doxycyklin lyhörd promotor 20,21. Med användning av denna musmodell kringgår de oönskade biverkningarna av traditionella virala metoder för iPS cellgeneration, dvs en heterogen startpopulationen med cell till cell variation i antalet och placeringen av integrations områden av virala skär. Två transgena musstammar (OKSM, m2rtTA), som finns som homozygota grundardjur vid Jackson Laboratory, har passeras för att fastställa reprogrammable musmodell (se figur 2). I detta manuskript beskriver vi i detalj hur man härleda MEF, generera iPS-celler, och isolera omprogrammeringar mellan i olika skeden av omvandlingsprocessen med FACS.
För att framgångsrikt omprogrammera MEF in i iPS-celler och att rena omprogrammeringar intermediärer vid hög kvantitet är det viktigt att vara medveten om faktorer som inverkar på den totala effektiviteten. I synnerhet det parti FBS användas som komplement till iPS medier kan ha en skadlig effekt. I allmänhet positiva erfarenheter gjordes med embryonala stamceller (ES) cell kvalificerade FBS men partiprovning av sera från en mängd olika leverantörer skulle kunna identifiera ett billigare alternativ.
En annan faktor som påverkar om omprogrammering effektiviteten är genotypen i MEF 15,20. Även MEFs härledda från möss heterozygot (het) för både OKSM och m2rtTA locus behöver omprogrammera homozygousity vid en eller båda loci resulterar i högre omprogrammering effektivitet. Faktum MEF härrör från avkomma OKSM och m2rtTA kors visar en ökning av omprogrammering effektivitet i följande ordning (OKSM / m2rtTA): het / het <homo / het <het / homo <homo /homo (observera att de nummer som anges i tabell 1 är för het / het djur). Vid de sällsynta tillfällen en manlig homo / homo djur identifieras, kan ett harem parning med flera m2rtTA honor inrättas. All avkomma från dessa korsningar kommer att Het / homo för OKSM / m2rtTA loci, respektive. Dessutom är den snabba genotypning av kullar rekommenderas som större kullar erhålls vid användning av yngre möss för avel (6-15 veckors ålder).
Dessutom är användningen av låga passage MEF för omprogrammering betonas 23. Om MEF härleddes och expanderade i en normoxisk vävnadsodling inkubator vi rekommenderar starkt att endast använda dessa celler upp till passagen 2. Om laboratoriet har tillgång till en låg syre inkubator (5% syre) för härledning och expansion av MEF, passagenummer så höga som 3 kommer fortfarande att ge goda resultat 23.
Vid försöks påträffar problem förknippade med omprogrammering, som beskrivs, de mest sannolika förklaringarna är höga passagenummer vid tidpunkten för dox dessutom felaktig genotyp av mössen eller användning av FBS som inte bidrar till iPS-cell generation. Men i sällsynta fall vi observerade att MEF inte kunde programmera även under idealiska förhållanden. I dessa fall en spontan de novo deletion inom m2rtTA s öppna läsram identifierades som den underliggande orsaken.
Denna metod har framgångsrikt anpassat för att extrahera SSEA-1 + mellan via magnetisk cellisolering (MACS). Det finns en tydlig tids fördel med att använda MACS dock de SSEA-1 + cellpopulationer "renhet minskat till 80-90%, i stället för mer än 95%, vilket beroende på typ av experiment cellerna är avsedda för kan utgöra ett problem. Således är ett alternativ att använda MACS att anrika SSEA-1 + celler följt av FACS att öka renhet och / eller fraktion dem i SSEA-1 + / EpCAM + och SSEA-1 + / Epcam- celler.
"> Medan iPS-celler som produceras av den skisserade protokoll och musmodell har visats vara pluripotenta och effektivt sätt bidra till alla vävnader i chimera djur 15,20, har en nedsatt förmåga att producera embryon som helt består av dessa iPS-celler via tetraploid komplemente varit visade 24. Avvikande metyleringsmönster på Dlk-DIØ3 genkluster har identifierats som den bakomliggande orsaken. 24 kommer dock att tillägg av askorbinsyra i en koncentration av 50 ug / ml till medierna under omprogrammering producera tetraploid komplemente kompetenta iPS-celler 24. Observera att en alternativ omprogrammerbart musmodell för att uttrycka de omprogrammeringar faktorer i en annan stökiometri kan producera tetraploida kompetenta iPS-celler även i frånvaro av askorbinsyra behandling 25. Men i våra händer cellerna från denna stam Programmera till betydligt lägre frekvens jämfört till häri används läget musl.Den metod som beskrivs i detta manuskript medger separation av omprogrammering mellan från eldfasta delen av befolkningen och bör ses som värdefullt verktyg för att dissekera och förstå omprogrammering processen, ta bort de tidigare begränsningarna för att behöva använda en ofraktionerat population för profilering (t.ex. hög signal buller från de eldfasta celler). Kombinationen antikropp som beskrivs häri medger isolering av mellanprodukter från musceller med hög renhet, men det är möjligt att ytterligare cellytmarkörer ska avslöjats i framtiden som gör det möjligt att få mellan på ännu högre renhet. Observera att SSEA-1 uttryck är inte ett kännetecken för mänskliga inducerade pluripotenta stamceller och som sådan här protokollet inte kan användas på omprogrammera celler av mänskligt ursprung. Sammanfattningsvis kan omprogrammeringsinstruktioner intermediärer gång isolerats med den beskrivna metoden användas för molekylära analyser inklusive uttryck profiling, kromatin immunoprecipitation, methylome analys och proteinanalyser.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka för det ekonomiska stödet från Monash Larkins Program samt från en NHMRC CDF och NHMRC projektbidrag. Vidare vill vi tacka Sue Mei Lim för hennes konstruktiva förslag, Edwina McGlinn för hennes stöd och Monash Flowcore laget (särskilt Adam Dinsdale) för hjälpen med videon.
Anti-mouse CD90.2 (Thy1.2) Pacific Blue | eBioscience | 48-0902-82 | |
Anti-Human/Mouse SSEA-1 Biotin | eBioscience | 13-8813 | |
Streptavidin PE-Cy 7 | eBioscience | 25-4317-82 | |
Anti- Mouse CD326(Epcam) Fitc | eBioscience | 48-5791-82 | |
Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Life Technologies | 11140-050 | |
Embryonic Stem Cell qualified Foetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 10439024 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Life Technologies | 25200-056 | |
GlutaMAX | Life Technologies | 35050-070 | |
β-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140 | |
Propidium Iodide solution (PI) | Sigma-Aldrich | P4864-10ML | |
Gelatine from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
Doxycyclin hyclate | Sigma-Aldrich | 33429-100MG-R | |
Leukemia Inhibitory Factor (LIF) | Millipore | ESG1107 | |
DMEM High Glucose | Life Technologies | 11960-044 | |
DPBS (Dulbecco s phosphate buffer saline) | Life Technologies | 14190-144 | |
KnockOut DMEM | Life Technologies | 10829-018 | |
Irradiated MEFs | Life Technologies | S1520-100 | |
75-cm2 Tissue culture flasks | Corning/BD Bioscience | 430641 | |
15-ml centrifuge tubes | Corning/BD Bioscience | 430791 | |
50-ml centrifuge tubes | Corning/BD Bioscience | 430829 | |
Disposable surgical blades | Disposable surgical blades | 201 | |
Cryogenic vials | Corning/BD Bioscience | 430487 | |
70 µm Cell strainer | BD Bioscience | 352340 | |
Taq DNA Polymerase | Life Technologies | 10342-020 |