Protokoll för effektiv beredning av homogena prover av spinnkvalster, angrepp av experimentella växter och bedömningen av växtskador, vilket krävs för studier av samspelet växt-pest utvecklades.
De två växthusspinnkvalster, Tetranychus urticae, är en allestädes närvarande polyphagous leddjur växtätare som livnär sig på ett anmärkningsvärt brett spektrum av arter, med mer än 150 av ekonomiskt värde. Det är ett stort skadedjur av växthusgrödor, särskilt i Solanaceae och Cucurbitaceae (t.ex., tomater, auberginer, paprika, gurka, zucchini) och växthusprydnadsväxter (t.ex. rosor, krysantemum, nejlikor), årliga fältgrödor (såsom majs, bomull, sojabönor och sockerbetor), och i perenna kulturer (alfalfa, jordgubbar, druvor, citrus, och plommon) 1,2. Förutom den extrema polyphagy som gör det till en viktig jordbruks skadedjur, T. urticae har en tendens att utveckla resistens mot ett brett spektrum av insekticider och kvalstermedel som används för dess kontroll 3-7.
T. urticae är en utmärkt experimentell organism, eftersom det har en snabb livscykel (7 dagar vid 27 ° C)och kan lätt upprätthållas vid hög densitet i laboratoriet. Metoder för att analysera genuttryck (inklusive in situ hybridisering och antikroppsfärgning) och inaktivera uttrycket av spindel kvalster endogena gener med hjälp av RNA-interferens har utvecklats 8-10. Nyligen, den hela genom ordnar av T. urticae har rapporterats, vilket skapar en möjlighet att utveckla denna skadegörare växtätare som modellorganism med motsvarande iska resurser som redan finns i några av sina värdväxter (Arabidopsis thaliana och tomaten Solanum lycopersicum) 11. Tillsammans kan dessa modellorganismer ge insikter i molekylära grunderna för växt-skadegörare interaktioner.
Här är en effektiv metod för snabb och enkel samling av ett stort antal vuxna kvinnliga kvalster, deras tillämpning på experimentell växtvärden, och bedömningen av växtskador på grund av spinn utfodring beskrivs. Den presenterade protokollet svkundfordringar snabb och effektiv samling av hundratals personer vid varje utvecklingsstadium (ägg, larver, nymfer, vuxna hannar och honor) som kan användas för efterföljande försöket.
Interaktion Växt skadedjur är ett ämne av stor vetenskaplig och ekonomisk betydelse. Det var historiskt studeras med hjälp av både grödor (t.ex. tomat) och modellväxten, A. thaliana. I båda fallen kunde känsligheten hos växten till gräsätande mätas antingen direkt genom bedömning av växtfenotyp efter herbivore angrepp eller indirekt genom bedömning av skadedjur prestanda.
Direkta mätningar av växt känslighet utnyttjades tidigare för ett antal insektsarter med hjälp av en rad olika metoder. Till exempel är herbivory av lepidoptera-larver mättes som en uppskattning av den del av växtvävnad som förbrukas av antingen Plutella xylostella (kålmal) eller Trichoplusia ni (cabbage looper) med blotta ögat med hjälp av ett galler 12. Också, finns det metoder som utnyttjar digital avbildning av bladskador med efterföljande kvantitativ bildanalys. Sådana metoder användes istudier av A. thaliana interaktion med Frankliniella occidentalis (västra blomma trips) 13, Scaptomyza flava (blad-mining drosophila) 14, och T. ni 15.
Indirekta mätningar av växt känslighet används ofta i studier av samspelet växt-skadegörare. Exempelvis mottagligheten hos A. thaliana att persika bladlöss Myzus persicae herbivori normalt bedöms genom analys av skadedjur fruktbarhet och beskrivning av brutto morfologi av en anläggning efter interaktion 16,17. En annan typisk indirekt indikator på A. thaliana mottaglighet för ett skadedjur är en torr eller våt vikt bedömning av gräsätande. Denna parameter används ofta för att karakterisera herbivory av lepidoterans såsom Pieris rapae (liten vit), P. xylostella eller T. ni på deras larver eller PUPP steg 15,17.
Spider kvalster är cell-innehåll feEders. Mite-inducerad skador erkänns som en samling chlorotic fläckar som varierar i färg från vit till blekt grönt. Risken för att en anläggning värd för spinn herbivory tidigare bedömts antingen indirekt genom analys av spindel kvalster prestanda dagar efter angrepp 18,19, eller direkt med grov morfologi av växter veckor efter angrepp 18 eller med hjälp av en digital avbildning av löv exponerade mot kvalster i dagar med efterföljande automatiserad bildanalys 19. Dessa metoder utvecklas och används för studier av växelverkan mellan tomatplantor och T. urticae, och används typiskt litet antal spinnkvalster (5-15 per behandling) som samlades in från den blandade kvalsterpopulationen och släppts ut på bladytan med en mjuk borste. Men dessa metoder är inte lämpliga för studier där ett större antal kvalster måste tillämpas. Dessutom, medan direkt bearbetning av blad bilder i bildanalysmjukvaratill exempel Adobe Photoshop (San Jose, CA) eller ImageJ 20 kan användas för analys av tomatskador, dessa protokoll behöver ändras för att kunna tillämpas på bladen som har större reflektionsförmåga av ytan eller är lätt färgad och har mycket synliga trichomes ( t.ex. A. thaliana) som stör automatiserad urval av chlorotic fläckar som markerar växtskador. Dessutom är utvecklingsstadiet av spinnkvalster som lätt kan utnyttjas med de tidigare metoderna begränsade till de vanligaste och lätt identifierbara vuxna kvinnor och utesluter utnyttjande av andra utvecklingsstadier.
Den första kritiska steget mot high-throughput analys av växt-spinn interaktion är att skapa reproducerbara, enkla och robusta protokoll för att utmana växter med spindelkvalster och tillförlitligt bedöma interaktions utfall.
I den här filmen, en effektiv metod för snabb och enkel samling av ett stort numlet vuxna kvinnliga kvalster, är deras tillämpning på experimentell växtvärden, och bedömningen av växtskador på grund av spinn utfodring beskrivs. Den presenterade protokollet möjliggör snabb och effektiv uppsamling av hundratals personer vid varje utvecklingsstadium (ägg, larver, nymfer, vuxna hannar och honor) som kan användas för efterföljande försöket. Dessutom kan dessa protokoll tillämpas på alla kvalster värdväxt, men som särskilt visats i fallet med A. thaliana.
Denna video visar protokoll som används för att isolera och att angripa växter med ett stort antal vuxna kvinnliga kvalster. Även om vi presenterade detta protokoll med hjälp av A. thaliana, kan den användas för någon växt-spinn interaktion systemet och för närvarande med framgång tillämpas även på tomat och vinranka (Vitis vinifera) växter. Protokollet ger reproducerbara resultat, vilket indikerar att insamlade kvalster är av jämförbar fysiologiska tillstånd (Figur 3).</str…
The authors have nothing to disclose.
This project was funded by the Government of Canada through Genome Canada and the Ontario Genomics Institute (OGI-046), and Ontario Research Fund–Global Leadership in Genomics and Life Sciences GL2-01-035 (to M.G. and V.G.). T.V.L. is a postdoctoral fellow of the Fund for Scientific Research Flanders (FWO).
Plant material: | |||
California red kidney bean | Stokes, Thorold, ON, Canada | NA | Two week old, well infested with spider mites two or three days before use. Other cultivars of Phaseolus vulgaris can be used. |
Chemicals: | |||
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | 1% stock solution is prepared to simplify aliquoting |
Tap water | Any supplier | NA | At room temperature, heat- and cold-shock affect mite survival rate and peformance |
Other materials and equipment: | |||
Plastic tray | Any supplier | NA | – |
Set of scissors | Any supplier | NA | – |
2 L beakers | Any supplier | NA | – |
Paper towels | Any supplier | NA | – |
Sets of sieves | Manufactured in house | NA | Detailed instructions are available |
Thin brush | Any supplier | NA | – |
Pipettes | Any supplier | NA | – |
Pipette tips | Any supplier | NA | 0.2 and 1 mL |
1.5 mL centrifuge tubes | Any supplier | NA | – |
Air pump | Any supplier | NA | Aquarium type pump with inverted air flow. Vacuum line can be used. Required pressure drop is approx. 2-4 psi |
Stereoscope | Any supplier | NA | – |
Scanner | Epson | V30 | Any flatbed scanner allowing necessary degree of control over scan quality. We use Epson V30 for our experiments. |
Computer | Any supplier | NA | Windows or OS X PC which is compatible with scanner hardware and Adobe Photoshop software. |
Adobe Photoshop software | Adobe Systems Inc., San Jose, CA, USA | various | Any version with Histogram tool included. |