Latexagglutinationstest test er en enkel, hurtig og billig metode til serotypning Streptococcus pneumoniae, og har også været almindeligt anvendt i diagnostisk mikrobiologi. Dette håndskrift beskriver in-house produktion af latexagglutinering reagenser, procedurer for kvalitetskontrol, og anvendelsen af denne teknik til pneumokok serotypning.
Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major cause of morbidity and mortality world-wide. Current vaccines target the pneumococcal capsule, and there are over 90 capsular serotypes. Serotyping pneumococcal isolates is therefore important for assessing the impact of vaccination programs and for epidemiological purposes. The World Health Organization has recommended latex agglutination as an alternative method to the ‘gold standard’ Quellung test for serotyping pneumococci. Latex agglutination is a relatively simple, quick and inexpensive method; and is therefore suitable for resource-poor settings as well as laboratories with high-volume workloads. Latex agglutination reagents can be prepared in-house utilizing commercially-sourced antibodies that are passively attached to latex particles. This manuscript describes a method of production and quality control of latex agglutination reagents, and details a sequential testing approach which is time- and cost-effective.
This method of production and quality control may also be suitable for other testing purposes.
Streptococcus pneumoniae (pneumokok) er en væsentlig årsag til sygelighed og dødelighed i børn under fem år på verdensplan, især i ressourcefattige indstillinger 1,2. Pneumokoksygdom spænder fra lokaliserede infektioner til livstruende tilstande, såsom lungebetændelse, sepsis og meningitis 1,2.
Mere end 90 serotyper af pneumokokker er blevet identificeret ud fra forskelle i deres kapselpolysaccharid 3. Aktuelle vacciner målrette kapselpolysaccharidet og yde beskyttelse mod de store serotyper, der forårsager invasiv sygdom 4. Serotypning pneumokokisolater er vigtig for at vurdere virkningen af vaccination mod transport og sygdom samt give bredere epidemiologiske oplysninger 5,6. Den nuværende "gyldne standard" metode til pneumokok serotypning er Quellung test, men det er tidskrævende og kræver en vis færdighed at Perform 7. Latexagglutinering er en alternativ serotypning, der anbefales af WHO 7. Latexagglutinering er hurtig og enkel at udføre, og er ansat i mange laboratorier verden over 8-11. Vigtigere er det, har latexagglutinering vist sammenlignelig nøjagtighed til Quellung testen for pneumokok serotypning 10,12-14. Samlet set er denne metode er ideel til ressourcesvage indstillinger samt høj kapacitet laboratorier.
Latexagglutinering reagenser ("latex reagenser ') er skabt af binding af antistoffer til latexpartikler 15. Ved en positiv reaktion, disse mærkede partikler agglutinere i nærvær af antigen. Kommercielle latexreagenserne er til rådighed for et begrænset udvalg af serotyper. Latex reagenser kan også fremstilles i huset ved hjælp af kommercielt tilgængelige antisera 10. Blandinger af antisera ("pools"), samt specifikke antisera til pneumokok serogroups (fx gruppe 19), individuelle serotyper (f.eks serotype 5) og til specifikke antigener (»faktorer«, f.eks. faktor 19c anerkende serotype 19A) for yderligere at definere serotyper inden for grupper er tilgængelige 16.
Dette håndskrift skitserer de vigtigste trin i produktionen af latexreagenserne bruger passive fastgørelse af kommercielt tilgængelige antisera til latex partikler. De kvalitetskontrol (QC) aspekter af denne metode er beskrevet, samt en protokol for brug af latex reagenser til pneumokok serotypning er inkluderet.
Latexagglutinering er en enkel, hurtig og billig metode til pneumokok serotypning. Kommercielle pneumokok latexagglutinering reagenser er til rådighed, men de har i øjeblikket skelner ikke alle kendte pneumokokserotyper 10,12. Dog kan latexagglutinering reagenser let fremstilles i-huset ved hjælp af indkøbt antisera rejst mod specifikke pneumokok kapselantigener. I den her beskrevne fremgangsmåde er antistoffer passivt bundet til latexpartikler at lave et sæt af latex agglutination reagenser.
En positiv latex reaktion opstår, når specifikke antistoffer bundet til latexpartikler tillægger antigener på polysaccharidkapslen af pneumokok isolere 18,19. De latexpartikler, der er knyttet til antistofferne tillade specifik antistof-antigen-reaktion visualiseres uden forstørrelse.
Latexagglutinering er en egnet metode til high throughput laboratorier end også for ressourcesvage indstillinger. Vigtige fordele ved latexagglutinationstest metode er, at nogen specialiseret udstyr er påkrævet til at udføre testen, reagenser har en holdbarhed på mindst 2 år ved opbevaring ved 4 ° C 8, og at den er billig, enkel og hurtig at udføre. Serotypning en pneumokok isolat af latexagglutinering tager cirka 10 minutter, og op til fire latexreagenserne kan testes parallelt på et objektglas. Desuden, hvis forekomsten af serotyper er kendt for de relevante epidemiologiske indstilling, prøvning kan udføres i runder starter med puljer, der indeholder de mest almindelige serotyper lighed med Quellung prøve 17. Denne fremgangsmåde minimerer antallet af nødvendige tests for at bestemme serotype. Fremgangsmåden er også meget reproducerbar mellem forskellige operatører (data ikke vist). En ulempe ved latexagglutinationstest serotypning at fremstille reagenserne er tidskrævende, idet ca 4 timer; selvom flere ReageNTS kan nemt fremstilles parallelt. Desuden er nogle antigener er fælles på tværs af forskellige pneumokok serotyper, hvilket resulterer i krydsreaktioner med nogle antisera (f.eks serotype 29, 42 og Gruppe 35). Men disse krydsreaktioner godt karakteriseret ved brug af kommercielle antisera (som normalt præabsorberet at fjerne de mere problematiske krydsreagerende antistoffer) og yderligere reaktion tabeller leveres af producenten for at skelne hvilken serotype er til stede. Latex reagenser kan også krydse reagere, hvis antistofferne ikke er justeret korrekt på latexpartiklerne; disse er detekteret som QC fiaskoer. Det er vores erfaring, streng QC er central for succesen af denne metode, selv når kommercielt tilgængelige antisera anvendes til produktion. QC tager cirka 15 minutter pr reagens og bygger på et sæt af passende QC isolater som beskrevet ovenfor.
Den her beskrevne metode resulterer i reagenser, der giver en positiv reaktion godt witynd testperioden. Det er vores erfaring, falske positiver er sjældne i praksis (data ikke vist). Lejlighedsvis falske negative reaktioner observeres; normalt disse vedrører kendte problemer med en bestemt antiserum (fx kan serogruppe 6 isolater ikke reagere med pool B antiserum) eller nedregulering af kapsel ekspression ved isolatet. Ved hjælp af serotypning algrorithm leveret af producenten er også vigtig, som i de fleste tilfælde en falsk positiv eller negativ reaktion vil føre til en "blind ende 'resultat. I disse tilfælde, og når reaktionerne er vanskeligt at fortolke, anbefaler vi gentage-test og / eller undersøgelser af en alternativ metode såsom Quellung reaktion.
Nogle fejlfinding lejlighedsvis forpligtet til at foretage en tilfredsstillende latex reagenser. I den her beskrevne fremgangsmåde er antistoffet bundet til latexpartikler via passiv adsorption 15,19, så en kritisk variabel er den koncentration af antistof, der anvendes, som afgør, hvor godtoverfladen af latexpartikler er dækket, og den efterfølgende justering af antistof aktive sites 15,20. Derfor, hvis utilstrækkelige eller overskydende antistof bundet til latexpartiklerne, antistof-antigen-reaktioner vil ikke være optimal, og utilfredsstillende reagenser kan fremstilles 15,20,21. Som antistoftitere varierer mellem forskellige partier af antisera, kan et standard sæt af fortyndinger ikke producerer reagenser, der klarer sig godt 8. Et godt udgangspunkt er at bruge en 1:40 fortynding af antiserum, og hvis dette ikke lykkes, fortyndes antiserum yderligere. Det er vores erfaring dette normalt løser problemet 8. I et lille antal tilfælde reagenser kan vise svag agglutination, der ikke er ledsaget af rydning af suspensionen, når det testes med target-isolater. I disse tilfælde fortynding antiserum ikke forbedre kvaliteten af reagenset, men tilfredsstillende reagenser kan normalt fremstilles ved at udelade centrifugering og vask trin 8,22 </sup>.
Antistofovertrukne latex partikler anvendes almindeligt i diagnostisk mikrobiologi til detektering, identificering eller serotypning af mange forskellige mikrober 15,20. Som sådan kan den her beskrevne fremgangsmåde være egnet til fremstilling af latex reagenser til andre formål, forudsat passende antisera er til rådighed og tilstrækkelige QC procedurer er vedtaget.
The authors have nothing to disclose.
This work was part of the PneuCarriage project, funded by the Bill and Melinda Gates Foundation with contribution by the Victorian Government’s Operational Infrastructure Support Program.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Microparticles based on polystyrene, 800 nm | Sigma | 65984-10 ml-F | Or other volumes as required |
Normal rabbit serum | Antibodies Australia | NRS-1ml | Or other volumes as required, bring to room temperature before use |
Pneumococcus (Neufeld) antisera | SSI Diagnostica | Various | Bring to room temperature before use http://www.ssi.dk/ssidiagnostica |
Sterile Bovine Albumin | Sigma | A-4503 | Bring to room temperature before use |
Sodium azide 10% (v/v) solution | VWR International | ROAC3902/100ml | Caution: hazardous if inhaled; skin and eye irritant |
Eppendorf Safe-Lock tubes, 2 ml | Eppendorf | 0030 120.094 | Round bottom |
Sodium chloride | Merck | 10241.AP | |
Calibrated disposable inoculating loops 1 µl | Copan | CD175SO1 | |
Glass microscope slides 76 mm x 26 mm | Thermo Fisher Scientific | LBS 2950RC | |
5 M NaOH | BDH | 10252 | Caution: highly corrosive |
Glycine | Merck | 10119.05 | |
Horse Blood Agar (HBA) plates | Thermo Fisher Scientific | PP2001 | Bring to room temperature before use http://www.thermofisher.com.au |
Rotating wheel | Wyble Engineering Development Corporation | Not available | |
Polystyrene flat bottom screw cap tube, 5 ml | Technoplas | S5016SU | |
60 ml syringes without needles | Terumo | SS-60L | |
Millex-GP syringe filter unit, 0.22 µm | Merck Millipore | SLGP033RS | |
Brochure on Neufeld antisera | Statens Serum Institut | Key to determining serotypes http://www.ssi.dk/ssidiagnostica |
|
Key to pneumococcal factor serum | Statens Serum Institut | 18058 | For determining serotype within Groups http://www.ssi.dk/ssidiagnostica |
*alternative sources are available for most materials |