Latex agglutinasjon testing er en enkel, rask og billig metode for Serotypebestemmelse Streptococcus pneumoniae, og har også vært mye brukt i diagnostisk mikrobiologi. Dette manuskriptet beskriver in-house produksjon av latex agglutinasjon reagenser, kvalitetskontrollen og anvendelsen av denne teknikken til pneumokokk serotyping.
Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major cause of morbidity and mortality world-wide. Current vaccines target the pneumococcal capsule, and there are over 90 capsular serotypes. Serotyping pneumococcal isolates is therefore important for assessing the impact of vaccination programs and for epidemiological purposes. The World Health Organization has recommended latex agglutination as an alternative method to the ‘gold standard’ Quellung test for serotyping pneumococci. Latex agglutination is a relatively simple, quick and inexpensive method; and is therefore suitable for resource-poor settings as well as laboratories with high-volume workloads. Latex agglutination reagents can be prepared in-house utilizing commercially-sourced antibodies that are passively attached to latex particles. This manuscript describes a method of production and quality control of latex agglutination reagents, and details a sequential testing approach which is time- and cost-effective.
This method of production and quality control may also be suitable for other testing purposes.
Streptococcus pneumoniae (den pneumokokker) er en viktig årsak til sykelighet og dødelighet hos barn under fem år på verdensbasis, spesielt i ressursfattige innstillinger 1,2. Pneumokokksykdom varierer fra lokaliserte infeksjoner til livstruende tilstander som lungebetennelse, sepsis og meningitt 1,2.
Mer enn 90 serotyper av pneumokokker er identifisert basert på forskjeller i deres kapselpolysakkarid tre. Gjeldende vaksiner målrette kapselpolysakkarid og gi beskyttelse mot de store serotyper forårsaker invasiv sykdom fire. Serotypebestemmelse pneumokokk isolater er viktig for å vurdere effekten av vaksinering på vogn og sykdom samt gi bredere epidemiologisk informasjon 5,6. Den nåværende "gullstandard" metode for pneumokokk serotyping er Quellung test, men det er tidkrevende og krever litt dyktighet til perform 7. Latex agglutinasjon er et alternativ serotyping metoden anbefalt av Verdens helseorganisasjon 7. Latex agglutinasjon er rask og enkel å utføre, og er ansatt i mange laboratorier verden over 8-11. Viktigere, har latex agglutinasjon vist tilsvarende nøyaktighet til Quellung test for pneumokokk serotyping 10,12-14. Totalt sett er denne metoden ideell for ressursfattige innstillinger samt høy gjennomstrømning laboratorier.
Latex agglutinasjon reagenser ('latex reagenser') er laget av festingen av antistoffer til latekspartikler 15. I en positiv reaksjon, disse merkede partikler agglutinerer i nærvær av spesifikt antigen. Kommersielle latex reagenser er tilgjengelig for et begrenset utvalg av serotyper. Latex reagenser kan også være forberedt på huset ved hjelp av kommersielt tilgjengelig antisera 10. Blandinger av antisera ('pools') samt spesifikke antisera mot pneumokokk serogroups (f.eks gruppe 19), individuelle serotyper (f.eks serotype 5), og til spesifikke antigener ("faktorer", f.eks., faktor 19c erkjenner serotype 19A) for videre å definere serotyper innenfor grupper er tilgjengelige 16.
Denne manuskriptet de viktigste trinnene i fremstilling av lateks ved hjelp av reagenser passive feste av kommersielt tilgjengelige antisera til latekspartikler. De kvalitetskontroll (QC) aspekter ved denne fremgangsmåte er beskrevet, og en protokoll for anvendelse av lateks-reagenser for pneumokokk serotyping er inkludert.
Latex agglutinasjon er en enkel, rask og billig metode for pneumokokk serotyping. Kommersielle pneumokokk latex agglutinasjon reagenser er tilgjengelige, men de for tiden ikke skille alle kjente pneumokokkserotypene 10,12. Imidlertid kan latex agglutinasjon reagenser være lett produsert i huset ved hjelp kjøpt antiserum mot spesifikke pneumokokkkapsel antigener. I fremgangsmåten som er beskrevet her, blir antistoffer passivt festet til latekspartiklene for å lage et sett av lateks agglutinasjon reagenser.
En positiv latex reaksjon oppstår når spesifikke antistoffer bundet til latekspartikler fester seg til antigener på polysakkaridet kapsel av pneumokokk isolere 18,19. Lateks-partiklene festet til antistoffene tillate det spesifikke antistoff-antigen-reaksjon bli visualisert uten forstørrelse.
Latex agglutinering er en egnet metode for høy gjennomstrømning laboratorier end også for ressursfattige innstillinger. Viktige fordeler ved latex agglutinering metoden er at det ikke spesialutstyr er nødvendig for å utføre testen, reagenser har en lagringstid på minst 2 år når de lagres ved 4 ° C til 8, og at det er billig, enkel og rask å utføre. Serotypebestemmelse en pneumokokk isolat av latex agglutinasjon tar ca 10 min, og opp til fire latex reagenser kan testes parallelt på den ene lysbildet. Videre, hvis prevalens av serotypene som er kjent for den aktuelle epidemiologisk innstilling, testing kan utføres i runder starter med puljer inneholdende de mest vanlige serotyper tilsvarende for Quellung test 17. Denne tilnærmingen reduserer antall tester for å bestemme serotype. Fremgangsmåten er også svært reproduserbare mellom ulike operatører (data ikke vist). En ulempe med latex agglutinering serotyping er at fremstilling av reagensene er tidskrevende, tar omtrent 4 timer; selv om flere reagensNTS kan lett bli produsert parallelt. Videre har en del antigenene er vanlige på tvers av forskjellige pneumokokkserotypene, noe som resulterer i kryssreaksjoner med noen antisera (som serotype 29, 42 og gruppen 35). Imidlertid er disse kryssreaksjoner godt karakterisert ved bruk av kommersielle antisera (som vanligvis preabsorbed å fjerne de mer problematiske kryssreagerende antistoffer) og ytterligere reaksjons tabeller er gitt av produsenten for å skille mellom hvilken serotype er til stede. Latex reagenser kan også kryssreagere hvis antistoffene ikke er skikkelig justert på latex partikler; disse er registrert som QC feil. Vår erfaring er strenge QC sentrale for å lykkes med denne metoden, selv når kommersielt tilgjengelige sera brukes til produksjon. QC tar omtrent 15 minutter per reagens og er avhengig av et sett av hensiktsmessige QC isolater som beskrevet ovenfor.
Metoden som beskrives her resulterer i reagenser som gir en positiv reaksjon godt witynn testperioden. Vår erfaring er falske positiver er sjeldne i praksis (data ikke vist). Sporadiske falske negative reaksjoner er observert; vanligvis disse relaterer seg til kjente problemer med en bestemt antiserum (f.eks, kan serogruppe seks isolater ikke reagere med basseng B antiserum), eller nedregulering av kapsel uttrykk ved isolatet. Bruke Serotypebestemmelse algrorithm levert av produsenten er også viktig, som i de fleste tilfeller en falsk positiv eller negativ reaksjon vil føre til en "blind end 'resultat. I disse tilfeller, og når reaksjoner er vanskelige å tolke, vi gjenta-testing og / eller testing av en alternativ metode som Quellung reaksjonen.
Noen feilsøking er tidvis nødvendig å foreta tilfredsstillende latex reagenser. I fremgangsmåten som er beskrevet her, er antistoffet festet til latekspartikler via passiv adsorpsjon 15,19, slik at en kritisk variabel er den konsentrasjon av antistoff som brukes, som bestemmer hvor godtoverflaten av latekspartiklene er dekket og den etterfølgende justering av antistoff-aktive seter 15,20. Følgelig, dersom utilstrekkelig eller overskytende antistoff er festet til latekspartikler, antistoff-antigen-reaksjoner ikke vil være optimal, og utilfredsstillende reagenser kan fremstilles 15,20,21. Som antistofftitere variere mellom forskjellige partier av antisera, kan et standard sett av fortynninger ikke gi reagenser som gir gode resultater 8. Et nyttig utgangspunkt er å bruke en 1:40 fortynning av antiserum, og hvis dette ikke lykkes, fortynne antiserumet videre. Vår erfaring er dette vanligvis løser problemet åtte. I et lite antall tilfeller reagenser kan vise svak agglutinering som ikke er ledsaget av rydding av suspensjonen når den ble testet med target-isolater. I disse tilfellene fortynne antiserumet ikke forbedrer kvaliteten av reagenset, men tilfredsstillende reagenser kan vanligvis bli produsert ved å utelate sentrifugering og vask trinn 8,22 </sup>.
Antistoff belagt latex partikler brukes ofte i diagnostisk mikrobiologi for deteksjon, identifikasjon eller serotyping av mange ulike mikrober 15,20. Som sådan, kan fremgangsmåten som er beskrevet her være egnet for fremstilling av lateks-reagenser for andre formål, er gitt passende antisera tilgjengelig og tilstrekkelig QC prosedyrene fastsettes.
The authors have nothing to disclose.
This work was part of the PneuCarriage project, funded by the Bill and Melinda Gates Foundation with contribution by the Victorian Government’s Operational Infrastructure Support Program.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Microparticles based on polystyrene, 800 nm | Sigma | 65984-10 ml-F | Or other volumes as required |
Normal rabbit serum | Antibodies Australia | NRS-1ml | Or other volumes as required, bring to room temperature before use |
Pneumococcus (Neufeld) antisera | SSI Diagnostica | Various | Bring to room temperature before use http://www.ssi.dk/ssidiagnostica |
Sterile Bovine Albumin | Sigma | A-4503 | Bring to room temperature before use |
Sodium azide 10% (v/v) solution | VWR International | ROAC3902/100ml | Caution: hazardous if inhaled; skin and eye irritant |
Eppendorf Safe-Lock tubes, 2 ml | Eppendorf | 0030 120.094 | Round bottom |
Sodium chloride | Merck | 10241.AP | |
Calibrated disposable inoculating loops 1 µl | Copan | CD175SO1 | |
Glass microscope slides 76 mm x 26 mm | Thermo Fisher Scientific | LBS 2950RC | |
5 M NaOH | BDH | 10252 | Caution: highly corrosive |
Glycine | Merck | 10119.05 | |
Horse Blood Agar (HBA) plates | Thermo Fisher Scientific | PP2001 | Bring to room temperature before use http://www.thermofisher.com.au |
Rotating wheel | Wyble Engineering Development Corporation | Not available | |
Polystyrene flat bottom screw cap tube, 5 ml | Technoplas | S5016SU | |
60 ml syringes without needles | Terumo | SS-60L | |
Millex-GP syringe filter unit, 0.22 µm | Merck Millipore | SLGP033RS | |
Brochure on Neufeld antisera | Statens Serum Institut | Key to determining serotypes http://www.ssi.dk/ssidiagnostica |
|
Key to pneumococcal factor serum | Statens Serum Institut | 18058 | For determining serotype within Groups http://www.ssi.dk/ssidiagnostica |
*alternative sources are available for most materials |