Pelle dei mammiferi contiene una gamma diversificata di strutture - come i follicoli piliferi e le terminazioni nervose - che presentano modelli distintivi di organizzazione spaziale. Analizzando pelle come cavalcatura piatto approfitta della geometria 2-dimensionale di questo tessuto per produrre tutto spessore immagini ad alta risoluzione delle strutture cutanee.
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Articolo metodologico
Appartamento Monte Imaging di pelle di topo e la sua applicazione alla analisi del follicolo pilifero patterning e sensoriale Axon Morfologia
In questo articolo
Sommario
Abstract
La pelle è un tessuto altamente eterogeneo. Strutture intra-dermiche includono follicoli piliferi, i muscoli erettore del pelo, specializzazioni epidermiche (come gruppi di cellule di Merkel), ghiandole sebacee, nervi e terminazioni nervose e capillari. La disposizione spaziale di queste strutture è strettamente controllata su scala microscopica - come si è visto, ad esempio, nella disposizione ordinata di tipi cellulari all'interno di un singolo follicolo pilifero - e su scala macroscopica - come visto dagli orientamenti quasi identiche di migliaia di capelli follicoli in una regione locale di pelle. Visualizzazione queste strutture senza sezionare fisicamente la pelle è possibile a causa della geometria 2-dimensionale di questo organo. In questo protocollo, dimostriamo che la pelle del mouse può essere sezionato, fisso, permeabilizzate, macchiato, e ha chiarito come un oggetto a due dimensioni intatte, un monte piatto. Il protocollo consente una facile visualizzazione delle strutture cutanee nella loro interezza attraverso l'intero spessore di grandi aree di pelle optsezionamento iCal e ricostruzione. Immagini di queste strutture possono essere integrate con le informazioni sulla posizione e l'orientamento rispetto agli assi del corpo.
Introduzione
La pelle è uno dei più grandi organi del corpo, con importanti funzioni somato-sensazione, isolamento / termoregolazione e difesa immunitaria 1. Comprensione delle basi molecolari e cellulari della pelle sviluppo e la funzione è stata di interesse di lunga data per l'importanza fondamentale della pelle come un sistema biologico e la sua rilevanza per dermatologia. Pelle dei mammiferi contiene una varietà di strutture multicellulari, tra cui stratificazioni di cheratinociti, il tessuto connettivo dermico, diversi tipi di follicoli piliferi, le ghiandole sebacee, muscoli erettore del pelo, vasi sanguigni, e almeno una dozzina di classi distinte di affere....
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Protocollo
Questo studio è stato eseguito in stretta conformità con le raccomandazioni contenute nella Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health. Tutti gli animali sono stati trattati secondo approvata la cura degli animali istituzionale e l'uso comitato (IACUC) protocollo MO11M29 delle istituzioni mediche del Johns Hopkins. Consultare le linee guida Istituzionale cura degli animali e uso comitato per i metodi approvati di eutanasia locali. Indossare guanti, camice da laboratorio e occhiali di sicurezza quando si maneggiano fissativi aldeide o solventi organici.
1. Preparazione dei Materiali
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Risultati
Brightfield imaging flatmounts pelle può essere utilizzato per immagine afferenze cutanee sensoriali (Figura 3A 10) e modelli follicolo basato su melanina pigmentazione (Figura 4). Confocale di flatmounts pelle può essere utilizzato per definire la geometria di (1) gruppi di cellule Merkel, visualizzati con anti-citocheratina-6 o con AM colorante assorbimento (figure 3I-L), (2) i muscoli erettore del pelo, visualizzati con anti- actina muscolo liscio .......
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Discussione
Padronanza dei metodi di dissezione sopra descritti richiede solo pazienza, una mano ferma e un paio di buoni strumenti di dissezione. La pelle dissezione dorsale è relativamente facile, ma la coda e la pelle del piede dissezioni - soprattutto in età precoce postnatale - sono più impegnativo. In età precoce prenatale (ad esempio, prima di E15), la pelle è difficile da rimuovere senza strapparla. Opportunamente, per molti studi di crescita e patterning di strutture della pelle nei topi, gli eventi di interesse s.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano il Dr. Amir Rattner per gli utili commenti sul manoscritto. Con il sostegno dell'Howard Hughes Medical Institute.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 5-bromo-4-cloro-indololil fosfato (BCIP) | Roche | 11383221001 | |
| AM1-43 | Biotium | 70024 | |
| AM4-65 | Biotium | 70039 | |
| Alcool benzilico | Sigma | 402834 | |
| Benzil benzoato | Sigma | B-6630 | |
| Microscopio confocale | Zeiss | LSM700 | |
| Cy3-alfa anticorpo actina della muscolatura liscia | Sigma | C6198 | 1:400 |
| Citocheratina-8 | Studi sullo sviluppo Banca degli ibridomi | TROMA-I-c | 1:500 |
| Microscopio | |||
| Strumenti di dissezione | Fine Science Tools | forbici e pinze Rasoio | |
| Fluoromount G | EM Sciences | 17984-25 | |
| Formalina | Sigma | HT501320 | |
| Piatti in vetro | Pyrex | da 6 cm e 10 cm di diametro | |
| Amersham Biosciences | SE202P-10 | 10 cm x 8 cm x 1 mm | |
| Depilazione | Nair | ||
| Piattaforma rotante orizzontale | Hoefer | PR250 Agitatore | |
| Perni per insetti | Strumenti di scienza fine | 26002-20 | |
| Ketamina/xilazina | Sigma | K113 | |
| Nitroblue tetrazolium (NBT) | Roche | ||
| Olio Rosso O | Sigma | O0625 | |
| Paraformaldeide | Sigma | P6148 | |
| Lamette da barba | VWR | 55411-055 | |
| Anticorpi secondari | Invitrogen | Alexa-dye coniugato | |
| Sylgard-184 | Fisher Scientific NC9020938 | ||
| Piastre | 10 cm di diametro | ||
| Piastre | a 6 e 12 pozzetti |
Riferimenti
- Rook's Textbook of Dermatology. 8th ed. Burns, T., Breathnach, S., Cox, N., Griffiths, C. , Wiley Blackwell. (2010).
- Lee, J., Tumbar, T. Hairy tale of signaling in hair follicle development and cycling. Semin. Cell Dev. Biol. 23, 906-916 (2012).
- Masland, R. H.
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Ristampe e permessi
