הדמיה חיה של<em> דרוזופילה</em> הזחל Neuroblasts

Summary

פרוטוקול זה מפרט שיטה יעילה המשמשת לביצוע הדמיה תא חי בהקשר של מוח זחל בשלמותה. גישות הדמיה תא חי הן לא יסולא בפז לחקר חלוקות תא גזע עצביים סימטריות כמו גם תהליכים עצביים והתפתחותיות אחרים, לחשוף באופן עקבי מנגנונים שהתעלמו בעבר.

Abstract

תאי גזע מתחלקים סימטרי כדי ליצור שני תאי צאצאים עם פוטנציאל לא שוויוני גורל: תאי גזע עצמי חידוש ותא מבדל. בהתחשב את הרלוונטיות שלהם לפיתוח ומחלה, הבנת המנגנונים השולטים בחלוקת תא גזע סימטרי הייתה אזור חזק של מחקר. כי הם גנטי צייתנים ולעבור סיבובים רצופים של חלוקת תא בערך פעם בכל שעה, בתאי הגזע של מערכת העצבים המרכזית דרוזופילה, או neuroblasts, הם מודלים חיוניים לחקר חלוקת תא גזע. אודות 100 תאי גזע עצביים נמצאים סמוך לפני השטח של כל אחת משתי אונות מוח הזחל, מה שהופך את מערכת מודל זה שימושי במיוחד עבור מחקרי מיקרוסקופיה ההדמיה לחיות. בעבודה זו, נסקור מספר גישות בשימוש נרחב כדי להמחיש חלוקות תא גזע, ואנו פונים את היתרונות וחסרונות של אלה טכניקות שמעסיקות ניתקו לעומת רקמות מוח שלמות יחסית. אנחנו גם פירוט simplifפרוטוקול מטען המשמש לexplant מוח כולו מזחלים שלישיים instar הדמיה תא חי ויישומי ניתוח קבועים.

Introduction

תאי גזע לשמור על איזון של בידול והתחדשות עצמית כדי ליצור גיוון סלולארי במהלך התפתחות מוקדמת והחלפת תאים פגועים ברקמות בוגרות. רגולציה של הומאוסטזיס זה מונעת גם האובדן והתרחבות יתר של אוכלוסיית תאי גזע, אשר יכול לגרום לניוון רקמה מזיק או היווצרות גידול.

Neuroblasts (NBS) הם תאי הגזע העצביים למדו נרחב של מערכת דרוזופילה עצבים המרכזית (איור 1 א), כי הטופס הראשון בשלבים עובריים ^{1, 2.} NBS לעבור סיבובים חוזרים ונשנים של חלוקת תא לא סימטרית (ACD) כדי לייצר שני תאים נגזר על איפה ואיפה: בתאי גזע עצמי חידוש ותא מבדל. ACD מונחה על ידי centrosomes, האברונים שאינם קרומיים המשמשים כמרכזי microtubule-המארגן של רוב התאים ^3. במהלך מיטוזה, centrosomes NB לארגן ולכוון את ציר mitotic דו קוטבי יחד קוטב apical-הבזלייםציר ity. על המחשוף של NB החלוקה, גורמי פסגת גורל המציינים את גורל תאי גזע, וגורמי גורל בסיסיים המציינים בידול, הם הפרדה לתאי בת לא שווים.

במוח המרכזי הזחל, שני סוגים של NBS עשויים להיות מכובדים על ידי מספרם, מיקום, ביטוי גורם שעתוק, ושושלת תא (איור 1 א) ^4-6. הקלד אני NBS הם הנפוץ ביותר, ועל 90 שלהם לאכלס את הצדדים הקדמי והאחוריים של כל אונה אופטית של המוח ^7. NBS אלה מבטאים גורם שעתוק Asense (ASE), והם מחלקים את אופייני לNB עצמי חידוש אחד ותא אחד קטן יותר גנגליון אמא (GMC; איור 1). כל GMC עובר חטיבת מסוף יחידה ליצירת שני תאי עצב או גליה (איור 1). לעומת זאת, NBS שמונה סוג II המאכלסים את הצד האחורי של כל אונה אופטית חסר הבעת ASE ^5. הם עוברים ACDכדי לייצר NB עצמי חידוש אחד ואב אחד ביניים עצביים (INP).

INP, בתורו, מחלק סימטרי שלושה עד חמש פעמים. כל אחת מתוצאות הענפים אלה בהתחדשות של INP והייצור של GMC אחת ^4. באופן קולקטיבי, זהות NB הספציפית והצו הזמני של לידת GMC מולידים את הגיוון העצבי המדהים של מערכת העצבים המרכזית למבוגר.

הבנת הביולוגיה של התא שבבסיס NB ACD שופרה בהרבה באמצעות השימוש בטכניקות הדמיה תא חיות. פרוטוקולים שפורסמו בשימוש על ידי חוקרים לNBS חי התמונה משתנים במידה רבה. בסך הכל, עם זאת, שיטות אלו עשויות להיות מקובצים לשתי קטגוריות כלליות מאופיינות האם מוח הזחל נותר בשלמותה או באופן מכאני ניתק. לשניהם יש טכניקות יתרונות ברורים וחסרונות בהתאם ליישום של החוקר.

דיווחים מוקדמים חושפים divi תא NB החיהוא קונה כרוך במידה מסוימת של ניתוק הידני של מוח הזחל. פירוט פרוטוקולים אלה מריחת ⁸ או ⁹ מתגרה מלבד המוח כדי לגדול תרבויות עיקריות לטווח הקצר של NBS על coverslips זכוכית. כדי לשפר את ההדמיה, NBS העגול בדרך כלל שטוח על coverslips עם שתי שקופיות זכוכית ⁸ או רפידות agarose ^9. למרות שתאים שטוחים השתפרו אופטיקה, טכניקות אלה לעתים קרובות להוביל לפגמים המיטוטי NB, כוללים רגרסיה של תלם המחשוף וחוסר היכולת לחלק יותר מפעם אחת. לכן, פרוטוקולים שכוללים גם ניתוק ידני ועיוות פיזית של רקמת מוח הזחל בדרך כלל מתאימים רק לטווח קצר מאוד (כלומר., מחזור תא אחד או פחות) יישומים. כמו כן, חצי מעיכה או השטחת מוח שלם בין שקופיות זכוכית coverslips לחלוטין מגבילה את הזמן אפשר לבלות הדמיה דגימה שניתנה לכ 30 דקות תקופת ^10. למרות ההגבלה, thi זההגישה של נוצלה בהצלחת ^11-14.

מאמצים אחרונים לחית תמונה ניתקו מגבלת NBS עיוות פיזית של התאים המבודדים. טכניקות אלה הן שימושיות במיוחד עבור יישומים בהם יש צורך לקיים בתרביות תאים למחזורי חלוקת תא מרובים. לדוגמא, תאים מפוזרים ממוחם ניתק באופן ידני עשויים להיות מוטבעים באופן חלקי בקריש עשוי מהתערובת של פיברינוגן וטרומבין ¹⁵ להדמיה לטווח ארוך ^16. לחלופין, מוח explanted עשוי להיות ראשון מבחינה כימית ניתק עם collagenase האנזים, ליד שיבש באופן ידני על ידי מעבר חוזר ונשנה באמצעות pipet קצה, ומצופה לאחר מכן במנות-ליזין המצופה פולי-L זכוכית תחתונה ^{17, 18.} ציפוי כלים מזכוכית עם או פיברינוגן או פולי-L-ליזין מקדם את הקובץ המצורף וקל התפשטות של תאים עגולים, להביא אותם קרוב לcoverslip אפשרי ללא עיוות פיזית גדולה. בadditiב, שיטות אלה כרוכים culturing NBS במדיום שניתן להחליף בקלות לניסויי הפרעות תרופתיים ^18. בסך הכל, באופן ישיר ציפוי התפזר NBS משפר אופטיקה הדמיה מבלי להקריב את יכולות הדמיה לטווח ארוך. לאחרונה, פרוטוקול המתאר את culturing לטווח הארוך של NBS ניתק כבר פורט ^19.

עם זאת, גישה זו אינה נטולת מגבלות. יש כמה אזהרות להדמית NBS ניתק בשידור חי. בתחום של תאים מפוזרים, למשל, קשה לזהות שושלות NB ספציפיות שמאורגנות במרחב במוח שלם ^1. כמו כן, הבחנה סוג I לעומת סוג השני NBS בתוך רקמה ניתקת היא גם מאתגרת ללא הביטוי של קליעים נותבים שושלת או transgenes תת סוג ספציפי, כגון worniu-GAL4, asense-GAL80 ^20. למרות transgenes אלה הם די שימושיים עבור יישומים מסוימים, הם מגבילים את החוקרים ללשעבר transgenes אלהלחץ תחת שליטתו של האלמנט משפר כטב"מ ²¹ ודורשים תוכניות גנטיות מורכבות יותר. מחקרים הנוגעים לפיתוח המרחבי או זמני של NBS, אם כן, דורשים בתחום ההדמיה vivo בהקשר של רקמה שלמה.

יתר על כן, מחקרים של NBS העוברי ניתק מצביעים על כך שהמגע הפיזי של תאים סמוכים הוא קריטי עבור לוקליזציה ביניים של קוטביות מפתח גורמי ^{22, 23.} מחקרים אלה מראים NBS המבודד לחלוטין כבר לא לשמור על ציר ציר mitotic בלתי משתנה. במקום זאת, תאים אלה להציג ציר ציר אקראי יותר וזוויות רחבים של הפרדה בין ניצני GMC הרצופים, אולי בשל אובדן מיצוב centrosome פסגת ^22. למרות שהקשר בין NBS הזחל ותאי השכנים שלהם לא נחקר בהרחבה, זה שווה בהתחשב בכך שmicroenvironment תאי גזע הזחל עשוי פוגע בקוטביות תא או אחרתהתנהגויות. כדי לשמור על ההקשר הפיזיולוגי של NBS זחל, אנו התמונה ACD מהמוח כולו.

בהתחשב במגבלות המבניות הקשורים NBS הדמיה ניתקה, המעבדה ועוד הקימו פרוטוקולים לסיבובים רצופים תמונה של NB ACD מהמוח של זחל כולו. טכניקות למוח בשלמות תמונה לעתים קרובות להחליף את המשטח הנוקשה של זכוכית בצד אחד של חדר התרבות עם קרום גמיש כדי למנוע עיוות רקמה או נזק ולאפשר חילוף גזים. חלק מהשיטות כרוכות בהרכבת מוח explanted בתערובת של מדיום חרקים culturing, סרום, וחומצה אסקורבית עם גופי השומן מבודדים מעשרה זחלים ^24. גופי השומן המבודדים מתווספים בגלל שהם מפרישים mitogen ידוע לעורר חלוקת תא NB ^25. פרוטוקול זה שומר על שלמות הרקמה במשך 3 שעות, והוא, אם כן, ניתן להדמיה לטווח ארוך ^{24, 26-28.} לאחרונה, פרוטוקול המתאר את לוןהדמיה גרם לטווח של מוח של זחל בשלמותה בנוכחות חומצה אסקורבית, סרום, וגופי שומן שפורטה ^29. חשוב לציין, כי הרקמה לא נחשפה ולא משותק, גישה זו היא פחות שימושית עבור יישומים בהם בינוני culturing הוא החליף (למשל, מחקרים בסמים, immunodepletion, וכו '.).

המעבדה שלנו יש לפשט את כל הכנת הר מוחות זחל חיים להדמיה לטווח ארוך ^{30, ביום 31.} היתרון העיקרי לפרוטוקול שלנו על פני אחרים הוא בפשטותו: התצפיות שלנו מצביעות גם בסרום, חומצה אסקורבית, אינסולין, ולא גופי שומן הם תוספים נחוצים כדי סיבובים רצופים תמונה של NB ACD. למרות שתוספים, כגון אינסולין, היו שימושיים עבור ההדמיה הממושכת של חלוקות תא גזע ³² ונדידת תאים קולקטיבית בשחלות דרוזופילה ^33, הם נראים מיותרים לNB ACD, כמדיום ההדמיה שלנו מורכב מתערובת פשוטה של STAndard הבינוני culturing תא חרקים בתוספת האנטיביוטיקה antimycotic על מנת למנוע זיהום. באמצעות השימוש בכלי תרבות שימוש חוזרים גז חדיר או זכוכית תחתונה, היינו מסוגל לקיים כמה סבבים של ACDs NB רצוף. דגימות explanted אותו יכול בקלות לשמש לimmunofluorescence והליכים אחרים עם רקמה קבועה. בפרוטוקול זה, אנו מפרטים את הנתיחה של מוח של זחל בשלמותה, כמו גם ההכנה של מוח לניתוח גם בשידור חי וקבוע.

Protocol

1. הכנת חומרים הדרושים לexplant מוח השלישי Instar הזחל הכן את הכלים דרושים לmicrodissection. לזייף שני כלים לנתח (אזמל וקרס) על ידי הצבת סיכה לנתח הסינגל ראשון לכל בעל פינים. אבטח את הס?…

Representative Results

הדמיה חיה כבר הובהרה מספר המנגנונים המווסתים NB ACD. לפני רכישת תמונה, יש צורך לקבוע את תנאי הדמיה אופטימליים. זה הכרחי כדי לאזן את שיעור לכידת המסגרת עם משך ההדמיה תא חי. לניתוח הסלולר בסדר, למשל, הגדיל את זמן וייתכן שתהיה הצורך ברזולוציה אופטית. כאשר חזותי מחזור אחד NB תא…

Discussion

הדמיה תא חי היא גישה לא יסולא בפז לשמש כדי לחקור את המנגנונים המווסתים ACD של תאי גזע, ההתמיינות של שושלות תאים, והמורפוגנזה של רקמות מורכבות. למרות שקבוצות המחקר היסטורית השתמשו במגוון של טכניקות כדי להמחיש NB ACD, הגישות הללו ניתן לקבץ בדרך כלל לשתי קטגוריות שבעיקר שונה…

Materials

Lumox Tissue Culture Dish 50X12 mm	Sarstedt	94.6077.410	A reusable culture dish with a gas-permeable and optically clear film base.
Schneider's S2 Medium	Invitrogen	21720-024
Gibco Antibiotic-Antimycotic (100x)	Invitrogen	15240-062	A supplement containing penicillin (10,000 U/mL), streptomycin (10,000 mg/mL), and amphotericin B (25 mg/mL) that is added to Schneider's S2 media to prevent bacterial and fungal contamination.
Glass coverslips, #1.5 22X22 mm	Fisher Scientific	12-541-B
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898	A high viscosity inert oil that is clear and colorless.
pair of nickel-plated pin holders, 17 cm long	Fine Science Tools	26018-17
Minutien dissecting pins	Fine Science Tools	26002-10
pair of Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-20
Dissecting needle/probe with plastic handle	Fisher Scientific	08-965-A
Syringe filter, 0.22 mm pore size	Fisher Scientific	09-719A
Syringe 5 mL	BD Biosciences	309646
plastic transfer pipet	Fisher Scientific	S30467-1
paraformaldehyde, 32% EM-grade	Electron Microscopy Sciences	15714	CAUTION: Formaldehyde is toxic; it should be handled in a fume hood. Follow MSDS guidelines for safe handling.
DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)	Invitrogen	D1306	A dye that labels DNA and is excited by UV light.
Aqua/PolyMount; Polysciences, Inc.	Fisher Scientific	18606-20	A water-soluble mounting medium.