Modelado astrocitoma Patogénesis In Vitro Y En Vivo Uso cortical astrocitos o células troncales nerviosas de ratones condicionales, Genéticamente Manipulados

Summary

Los astrocitos fenotípicamente salvajes y las células madre neurales recolectadas de ratones modificados con alelos oncogénicos condicionales floxados y transformados a través de la recombinación mediada por Cre viral se pueden utilizar para modelar la patogénesis del astrocitoma in vitro e in vivo mediante la inyección ortotópica de células transformadas en cerebros de compañeros de camada singénicos e inmunocompetentes.

Abstract

Los modelos actuales de astrocitoma son limitados en su capacidad para definir las funciones de las mutaciones oncogénicas en tipos específicos de células cerebrales durante la patogénesis de la enfermedad y su utilidad para el desarrollo preclínico de fármacos. Con el fin de diseñar un mejor sistema modelo para estas aplicaciones, se cosecharon y cultivaron astrocitos corticales fenotípicamente salvajes y células madre neurales (NSC) de ratones condicionales modificados genéticamente (GEM) que albergan varias combinaciones de alelos oncogénicos floxados. La recombinación genética se indujo in vitro mediante la recombinación mediada por Cre adenoviral, lo que dio lugar a la expresión de oncogenes mutados y a la deleción de genes supresores de tumores. Las consecuencias fenotípicas de estas mutaciones se definieron midiendo la proliferación, la transformación y la respuesta al fármaco in vitro. Se desarrollaron modelos de aloinjerto ortotópico, en los que las células transformadas se inyectan estereotácticamente en el cerebro de compañeros de camada singénicos inmunocompetentes, para definir el papel de las mutaciones oncogénicas y el tipo de célula en la tumorigénesis in vivo. A diferencia de la mayoría de los xenoinjertos de líneas celulares de glioblastoma humano establecidos, la inyección de astrocitos corticales derivados de GEM transformados en el cerebro de compañeros de camada inmunocompetentes produjo astrocitomas, incluido el subtipo más agresivo, el glioblastoma, que recapituló las características histopatológicas de los astrocitomas humanos, incluida la invasión difusa del parénquima cerebral normal. Se utilizaron imágenes de bioluminiscencia de aloinjertos ortotópicos de astrocitos transformados modificados para expresar luciferasa para monitorear el crecimiento tumoral in vivo a lo largo del tiempo. Por lo tanto, los modelos de astrocitoma que utilizan astrocitos y NSC recolectados de GEM con alelos oncogénicos condicionales proporcionan un sistema integrado para estudiar la genética y la biología celular de la patogénesis del astrocitoma in vitro e in vivo y pueden ser útiles en el desarrollo preclínico de fármacos para estas enfermedades devastadoras.

Introduction

Los astrocitomas son el tumor cerebral primario más común y glioblastoma (GBM), un astrocitoma de grado IV, es el subtipo más común y agresiva con una supervivencia media de 12 a 15 meses ^1,2. La invasión de los astrocitomas difusos, en particular GBM, se opone a la resección quirúrgica completa, limita la eficacia de las terapias adyuvantes, y conduce inevitablemente a la recurrencia después del tratamiento ^3. Los pacientes inicialmente presentes ya sea de novo (primaria) GBM o con astrocitomas de grado bajo que progresa inevitablemente a GBM (secundaria) ^4. GBM es genómicamente heterogénea y que se caracteriza por mutaciones mutuame....

Protocol

Todos los estudios con animales fueron aprobados por la Universidad de Carolina del Norte Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión.

1. cultivo cortical astrocitos de ratones recién nacidos

1. Preparación
   1. Arruga 2-3 tejidos de tareas delicadas y colocar en el fondo de un matraz que contiene 70% de etanol. Coloque tijeras de disección, fórceps curvos y 2 pares de pinzas de micro directamente en este frasco. Los tejidos se utilizan para evitar que se doblen las pinzas de micro.
   2. Añadir 1 ml de HBSS a una placa de 60 mm de cultivo de tejidos. Preparar un plato separado para cada animal y mantener los pl....

Results

Hemos desarrollado un sistema modelo nGEM con astrocitos corticales y NSC cosechadas de acogida GEM neonatal floxed alelos oncogénicos condicionales que se pueden caracterizar fenotípicamente in vitro e in vivo (Figura 1). Con el fin de investigar las consecuencias de mutaciones oncogénicas específicamente en astrocitos corticales in vitro, es crítico para enriquecer primero para astrocitos. Cosechas de astrocitos corticales contienen una mezcla de microglia, astrocitos, oligo.......

Discussion

Los pasos más importantes para garantizar la cosecha y cultivo de astrocitos corticales son 1) adecuado para extirpar la corteza sin tomar tejido debajo del cuerpo calloso, 2) para eliminar las meninges, 3) para disociar completamente las células, y 4) para enriquecer para GFAP ⁺ astrocitos. Aunque hemos utilizado mecánica (agitación) y genéticas (restricción de la recombinación genética con un vector de Ad5GFAPCre o la utilización de un transgén transformadora dominante (TgGZT ₁₂₁₎ bajo e.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)	Invitrogen	11995065	DMEM también se pueden comprar de otros proveedores, incluidos GIBCOSigma y Cellgro
Suero fetal bovino, regular	Cellgro	35-010-CV
Penicilina-estreptomicina	Invitrogen	15140122
Tijeras de disección de punta afilada	Fisher Scientific	08-395
Pinzas de cartílago para el pulgar, curvadas	Fisher Scientific	1631
Miltex 17-301 Style 1 Pinzas estilo joyero, finas, 4	Miltex	17-301
Etanol (200 grados)	Decon Labs	2710
Hojas de afeitar VWR		55411-050
Solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) (1x), líquido	Invitrogen	14175-095
TrypLE Express (1x), rojo de fenol	Invitrogen	12605-010	Otras soluciones de tripsina también son adecuadas para el uso de astrocitos corticales y el cultivo
Plato de cultivo, 60 x 15 mm	Thomas Scientific	9380H77
Tubos de 15 ml	BD Biosciences	352096
50 ml Tubos BD	Biosciences	352070
Stock de adenovirus	Transferencia de genes Vector Core, U. Iowa	Ad5CMVCre	Store en 5 µ l alícuotas a -80 °C. Peligroso. Utilice las precauciones de seguridad de Bsl2
Sulfato de sodio (Na2SO4)	Sigma-Aldrich	238597
Sulfato de potasio (K2SO4)	Sigma-Aldrich	221325 Cloruro
de magnesio (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M8266
Cloruro de calcio (CaCl2)	Sigma-Aldrich	746495
HEPES sal	de potasioSigma-Aldrich	H0527
D-(+)- Glucosa	Sigma-Aldrich	G8270
Rojo de fenol	Sigma-Aldrich	P3532
Hidróxido de sodio (NaOH)	Sigma-Aldrich	S5881
Papaína	Worthington	LS003127
L-Cisteína-HCl	Sigma-Aldrich	C1276
Filtro de jeringa (0,22 y micro; Kit	Millipore	SLGP033NS
Neurocult, ratón	Stemcell Technologies	5702	Este kit contiene el medio basal NeuroCult NSC y el suplemento NeuroCult NSC NSC necesarios para el cultivo de NSC
Solución de heparina al 0,2%	Stemcell Technologies	7980
EGF	Invitrogen	PMG8041
bFGF	Invitrogen	PHG0261
Solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) (10x)	Invitrogen	14185-052
Sulfato de magnesio (MgSO4)	Sigma-Aldrich	M7506
Bicarbonato de sodio (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761
E-64	Sigma-Aldrich	E3132	Hacer 10 mM de stock en DMSO, almacenar a -20 ° C
Placas de 6 pocillos	Fisher Scientific	07-200-83
Filtro de células (40 µ m tamaño de poro)	Corning	352340
Solución de disociación de células madre	Stemcell Technologies	5707	Alternativamente, use soluciones enzimáticas suaves como Accutase
Metilcelulosa 15 cP	Sigma-Aldrich	M7027
Dulbecco's Modified Eagle's Media 2x	Millipore	SLM-202-B	Para hacer una solución de metilcelulosa al 5%
1.7 ml Snap Cap Tubo de microcentrífuga	Corning	3620
Jeringa Hamilton, 250 y micro; l LT sin aguja	Fisher Scientific	14-815-92
PB600-1 Dispensador de antígenos	Hamilton	83700
Agujas desechables de 18 G	Fisher Scientific	NC9015638
27 ga 1/2" aguja con punta Luer	Fisher Scientific	14-826-48
2,2,2-Tribromoetanol (Avertin)	Sigma-Aldrich	T48402
Betadine	Fisher Scientific	NC9386574
Puralube Pomada Oftalmológica	Fisher Scientific
Modelo 900 Bastidor estereotáxico	Kopf Instruments
VETBOND	Fisher Scientific	NC9259532	Adhesivo de tejido
Lidocaína	ShopMedVet	RXLIDO-EPI
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS)	Promega	G3580
Anti-Sox2	Millipore	AB5603
Proteína ácida fibrilar antiglial policlonal de conejo (GFAP)	Dako	Z0334
IVIS Kinetic	PerkinElmer		Para in vivo imagen
D-Luciferina - Sustrato bioluminiscente de sal K+	PerkinElmer	122796	Para in vivo imágenes de bioluminiscencia
Kit de imagen EdU	Invitrogen	C10340
MSCV Luciferasa PGK-hygro	Addgene	18782