ヒト胚性幹細胞におけるターゲティングジンクフィンガーヌクレアーゼ遺伝子の強化
Summary
レポーター細胞株は、視覚追跡し、不均一な集団から目的の細胞を単離する手段を提供する。しかし、遺伝子ターゲッティングヒト胚性幹細胞は、従来の相同組換えを使用しては非常に非効率的である。本明細書では、ジンクフィンガーヌクレアーゼ増強相同組換えを使用して、EGFPとCNS中脳特異的転写因子PITX3遺伝子座を標的と記載している。
Abstract
現在のヒト胚性幹細胞（ESC）分化プロトコールの一つの主要な制限は、不均一な細胞集団の生成である。これらの培養は、目的の細胞を含むだけでなく、未分化ESCを、非神経誘導体および他のニューロンのサブタイプで汚染されている。これは、 インビトロで、そのような創薬または細胞置換療法のためのin vitroモデルとして、生体内用途におけるそれらの使用を制限する。これを克服するために、目的の細胞を可視化する追跡し、単離するための手段を提供するレポーター細胞株は、操作され得る。しかし、従来の相同組換えを介したヒト胚性幹細胞でこれを達成するためには非常に非効率的である。このプロトコルは、説明して一緒に、サイト固有の二本鎖DNA切断を導入、カスタム設計されたジンクフィンガーヌクレアーゼを用いて、ヒト胚性幹細胞における下垂体ホメオボックス3（PITX3）遺伝子座のターゲティングPITX3 – EGFP特異なDNAドナーベクター。 PITX3レポーター細胞株の生成に続いて、それは、次に、 インビトロパーキンソン病モデルまたは細胞置換療法として研究における使用のために公開されたプロトコルを使用して分化させることができる。
Introduction
現在、胚性幹細胞（ESC）の分化プロトコルは、特に特定のニューロン表現型の誘導に関して、不均一な細胞集団を生じる。培養物が所望の細胞表現型、他の神経を含んでいるがこのように、非神経および未分化細胞型は、多くの場合、1が存在する。これらの特性は、細胞置換療法およびin vitro疾患モデルにおける使用のための ESC由来する細胞供給源の適用を制限する。
遺伝子レポーター細胞株は、視覚追跡し、目的の細胞を単離するための手段を提供する、レポータータンパク質（RP）の発現は、内因性発現を再現することを条件とする。遺伝子コード領域のすぐ上流にプロモーターの使用は、粗遺伝子レポーターを導出するために使用することができるが、そのような構築物は、内在性遺伝子の発現を制御する正確な調節要素を欠いている。対照的に、相同組換えが提供RPの忠実度の高い発現を確実にする機会。過去には、目的の特定の遺伝子座での相同組換えのために設計されたターゲッティングベクターは、DNA送達1,2手段としてエレクトロポレーションを用いて、マウスのESC（たmESC）でRPを標的化するために使用されてきた。しかしながら、従来の相同組換えを介したレポーター細胞株の生成は、ヒトESC（hESCの）のための非常に非効率的であるため、唯一の（3日）の場合の一握りに記載されている。 Iは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFNは）と総称される部位特異的ジンクフィンガーモチーフでヌクレアーゼフォックの融合物を含む操作されたキメラタンパク質を用いて、DNA二本鎖切断は、予め決定されたゲノム遺伝子座に導入することができる。 DNA二本鎖切断の両側に相同性を有するDNAベクターを添加する場合、ゲノム部位は、DNAドナー配列の組み込みを可能にする、相同組換えによって修復することができる。この技術は有用fは証明されているまたはヒト初代細胞4,5及びヒトES細胞6,7の両方におけるゲノム編集。より最近の研究は、部位特異的ヌクレアーゼ9の設計を支援するために、転写活性化因子のようなエフェクターヌクレアーゼ（TALENS）、植物病原体8によって使用される転写因子を利用している。
以下のプロトコルでは、ヒト下垂体ホメオボックス3（PITX3）遺伝子座のためのZFNと一緒に相同ターゲティングベクター6を含むEGFPのエレクトロポレーションによってのhESCレポーター細胞株の生成を実証する。 2〜3週間のための抗生物質選択の後、正常に組み込まれたDNAでhESCを手動で拾い、拡大し、PCRを介して最初にスクリーニングし、続いてサザンブロット法によって検証することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
レポーター細胞株の生成は、追跡し視覚化し、ヒトES細胞から誘導された不均質な集団から目的の細胞を単離するための強力な手段を提供しています。しかし、従来の相同組換えによる遺伝子ターゲティングは、ヒトESC 3に極めて非効率的であることが証明されている。このプロトコルでは、ZFNを一緒に広く利用可能なターゲティングベクターを用いて、ヒトES細胞で、エクソンPITX…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
このプロトコルで説明する作業は再生医療のためのカリフォルニア研究所（CIRM）との共同提携の一環として、ビクトリア州政府からの資金提供によって可能になりました。
Materials
| Mouse Embryonic Fibroblasts (DR4) | GlobalStem | GSC-6004G | |
| Gelatin | Sigma | G1393-100ML | |
| HBSS, no Calcium, no Magnesium, no Phenol Red (HBSS) | Life Technologies | 14175-095 | |
| Dispase | StemCell Technologies | 7923 | |
| Cell Scraper | Corning | 3008 | |
| Accutase | Life Technologies | A11105-01 | |
| Y27632 | Axon Medchem | Axon 1683 | |
| Cell Strainer – 40um | BD Biosciences | 352340 | |
| 33mm – 0.22 um filter | Millipore | SLGP033RS | |
| rhFGF2 | R&D Systems | 233-FB-025/CF | |
| Electroporator | BioRad | 165-2661 | |
| 0.4cm electroporation cuvette | BioRad | 165-2088 | |
| Human TV-hPITX3-forward targeting construct | Addgene | 31942 | |
| ZFN Kit; Human PITX3 | Sigma-Aldrich | CKOZFN1050-1KT | |
| Puromycin | Invivogen | ant-pr-1 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Geltrex | Life Technologies | A1569601 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 10566-016 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, Heat Inactivated, US Origin (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15070-063 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Life Technologies | 11320-033 | |
| KnockOut Serum Replacement (KSR) | Life Technologies | 10828-028 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | |
| ß-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt solution (Sarcosyl) (30%) | Sigma-Aldrich | 61747 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Trizma Hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Proteinase K solution (20mg/ml) | Bioline Australia | BIO-37084 | |
| Expand Long Template PCR System | Roche Australia | 11681834001 | |
| hPITX3 L arm gen. F (primer): 5’ TGTCCTAAGGAGAATGGGTAACAGACA 3’ | GeneWorks, Australia | ||
| hPITX3 L arm GFP R (primer): 5’ ACACGCTGAACTTGTGGCCGTTTA 3’ | GeneWorks, Australia | ||
| HyperLadder 1kb | Bioline Australia | BIO-33025 | |
| GelRed | Jomar Bioscience, Australia | 41003 |
References
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