एक नैनोमीटर सटीकता के साथ प्रतिदीप्ति इमेजिंग (फियोना)
Summary
एकल fluorophores फियोना का उपयोग नैनोमीटर परिशुद्धता के साथ स्थानीयकृत किया जा सकता है. यहाँ फिओना तकनीक का सारांश सूचना दी, और कैसे फिओना प्रयोगों से बाहर ले जाने के लिए वर्णित है.
Abstract
एक नैनोमीटर सटीकता (फियोना) के साथ प्रतिदीप्ति इमेजिंग XY विमान में नैनोमीटर परिशुद्धता के साथ ही fluorophores स्थानीयकृत के लिए एक सरल लेकिन उपयोगी तकनीक है. यहाँ फिओना तकनीक का सारांश सूचना दी है और फिओना का उपयोग किया गया है कि अनुसंधान के उदाहरण संक्षेप में वर्णन किया गया हैं. सबसे पहले, कैसे प्रकाशिकी aligning पर विवरण के साथ यानी फिओना प्रयोगों, कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (TIRFM), के लिए आवश्यक उपकरण स्थापित करने के लिए, वर्णित है. तो कैसे एक क्वांटम डॉट के साथ लेबल एक भी छोटा कर दिया मायोसिन- Va मोटर की 36 एनएम कदम आकार को मापने के लिए फियोना के उपयोग के बाद उचित प्रोटोकॉल का उपयोग immobilized Cy3 डीएनए एकल अणुओं स्थानीयकृत पर एक सरल फिओना प्रयोग बाहर ले जाने के लिए, यह साफ है. अन्त में, मोटी नमूने लिए फियोना के आवेदन का विस्तार करने के लिए हाल के प्रयास की सूचना दी है. > (यह एक पानी विसर्जन उद्देश्य का उपयोग कर, कि दिखाया गया है और क्वांटम डॉट्स प जैल और खरगोश आंख कॉर्निया में गहरी लथपथ200 माइक्रोन), 2-3 एनएम का स्थानीयकरण परिशुद्धता प्राप्त किया जा सकता है.
Introduction
1882 के आसपास, अर्न्स्ट अब्बे एक दृश्य प्रकाश माइक्रोस्कोप का संकल्प है कि पाया ~ λ / 2NA, (λ तरंगदैर्ध्य है और एनए संख्यात्मक एपर्चर है) 1,2 ~ 200 एनएम या. इसलिए इस आयाम की तुलना में छोटे किसी भी वस्तु एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप में एक विवर्तन सीमित स्थान के रूप में प्रकट होता है. हालांकि, यह एक बहुत उच्च परिशुद्धता 3 के साथ है, उस स्थान का केंद्र, वस्तु का स्थान निर्धारित करने के लिए संभव है. एक नैनोमीटर सटीकता (फियोना) के साथ प्रतिदीप्ति इमेजिंग XY विमान 4 में नैनोमीटर परिशुद्धता के साथ ही fluorophores स्थानीयकृत के लिए एक सरल लेकिन उपयोगी तकनीक है. स्थानीयकरण की शुद्धता, σ μ (यानी, मतलब की मानक त्रुटि),, एकत्र फोटॉनों की कुल संख्या पर निर्भर करता है 
एन फोटॉन गिनती है, जहां, एस फ्लोरोसेंट मौके का मानक विचलन है, एक हैपिक्सेल इमेजिंग डिटेक्टर के आकार, और बी पृष्ठभूमि 3,4 का मानक विचलन है. ~ 10,000 फोटॉनों उत्सर्जन एक फ्लोरोफोरे के लिए, फिओना ~ 1 एनएम परिशुद्धता 4 प्राप्त कर सकते हैं.
फियोना सही रूप में एक स्थिर emitter की स्थिति, या (काफी तेजी से ले जाया जा सकता है छवियों संभालने) एक चलती एक निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. फियोना फिल्म के फ्रेम करने के लिए क्रमिक रूप से लागू किया है और इस तरह एक अणु 4 8 की गति को ट्रैक किया जा सकता है. फोटो सुरक्षात्मक अभिकर्मकों नमूना photodegrade नहीं है यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक हो सकता है. इसके अलावा, फ्लोरोसेंट वस्तु ही किसी भी आकार का हो सकता है, limit- जैसे विवर्तन से छोटा या बड़ा, यह अपनी झिल्ली पर छितरी कई फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ एक organelle (~ 1 माइक्रोन) से मिलकर कर सकते. फियोना अभी भी अपनी औसत केंद्र की जन की एक बहुत ही सटीक (नैनोमीटर) औसत उपज कर सकते हैं. फियोना ने स्थानीयकरण परिशुद्धता में काफी सुधार nanome को हल करने की अनुमति देता हैसमय के साथ आतंकवाद पैमाने पर आंदोलनों. इस आणविक लंबाई पैमाने 4 8 में माइक्रोस्कोपी धक्का दिया गया है.
अपने आविष्कार के बाद से, फिओना के संस्करण विकसित किया गया है. उदाहरण के लिए, उज्ज्वल क्षेत्र एक नैनोमीटर सटीकता (bFIONA) 9, फिओना के एक मामूली संस्करण, छवियों के साथ इमेजिंग और प्रेषित प्रकाश के साथ इस तरह melanosomes में विवो (वर्णक मेलेनिन युक्त अंधेरे वस्तुओं) के रूप में घने वस्तुओं localizes. इसके अलावा, फिओना कई रंगों को हल करने के लिए नियोजित किया गया है. उदाहरण के लिए, photobleaching (झींगा) के साथ एकल अणु उच्च संकल्प इमेजिंग 10,11 या एकल अणु उच्च संकल्प colocalization (SHREC) 12 के बारे में 10 एनएम के भीतर दो रंगों को हल करने के लिए विकसित किया गया है. (यह संकल्प है कि एक अलग समान रंगों बता सकते हैं कि कैसे सही ढंग से यानी, नोटिस.) हाल ही में, फिओना विश्लेषण कुछ सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी का स्थानीयकरण प्रक्रिया में योगदान दिया है ऐसे stochastic ऑप्टिकल सिफारिश के रूप मेंnstruction माइक्रोस्कोपी (तूफान) 13 15 और अस्थायी अंधेरे fluorophores उत्साहित कर रहे हैं, और उसके बाद प्रतिदीप्ति स्थानीयकृत है जिसमें फोटो सक्रिय स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (पाम) 16,. बार बार रोमांचक एक काफी कम रंगों के घनत्व (कम से कम एक प्रति विवर्तन सीमित स्थान), और फिर फियोना ने उनमें से प्रत्येक का विश्लेषण, प्रतिदीप्ति इकट्ठा करके, एक एक उच्च संकल्प के नक्शे का निर्माण कर सकते हैं. संकल्प तो सिर्फ एक डाई बाहर डालता फोटॉनों की संख्या है, साथ ही अधिग्रहण के दौरान (जैसे सहित, खुर्दबीन मंच) नमूना स्थिर रखने की तरह बातें द्वारा सीमित है.
इस पत्र में, एक फिओना तकनीक का सारांश और संक्षेप में फियोना बताया जाता है का उपयोग किया गया है कि अनुसंधान के उदाहरण का वर्णन. सबसे पहले, कैसे प्रकाशिकी aligning पर विवरण के साथ यानी फिओना प्रयोगों, कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (TIRFM), के लिए आवश्यक उपकरण स्थापित करने के लिए, वर्णित है. तो फिर कैसे करने के लिएउचित प्रोटोकॉल का उपयोग immobilized Cy3 डीएनए एकल अणुओं स्थानीयकृत पर एक सरल फिओना प्रयोग के लिए बाहर ले, यह साफ है. उसके बाद, फिओना का उपयोग एक क्वांटम डॉट के साथ लेबल एक भी छोटा कर दिया मायोसिन- Va मोटर की 36 एनएम कदम आकार को मापने के लिए प्रस्तुत किया है. मायोसिन- Va एक्टिन तंतु साथ translocating जबकि सेलुलर कार्गो किया जाता है जो एक आवश्यक processive मोटर प्रोटीन है. यहाँ Va छोटा निर्माण एक मायोसिन- कदम आकार के लिए अप्रासंगिक डोमेन हटाने के लिए प्रयोग किया जाता है, और एक झंडा टैग सी टर्मिनस के लिए जोड़ा साथ विरोधी झंडा एंटीबॉडी के साथ functionalized क्वांटम डॉट्स के साथ लेबलिंग की आसानी अनुमति देने के लिए. इस प्रयोग मायोसिन- धीमा और हर फ्रेम में एक अच्छा फोटॉन गिनती पाने के लिए काफी लंबे समय जोखिम बार के उपयोग की अनुमति के लिए कम एटीपी के तहत किया जाता है. किसी भी पर्याप्त उज्ज्वल फ्लोरोसेंट लेबल निम्नलिखित प्रोटोकॉल में प्रतिस्थापित किया जा सकता है. अन्त में, मोटी नमूने लिए फियोना के आवेदन को विस्तार देने के हाल के प्रयास की सूचना दी है. एक सबूत की सिद्धांत रूप में, क्वांटम डॉट्स लथपथ थेप जैल और खरगोश आंख कॉर्निया में और फिर imaged और फियोना का उपयोग स्थानीयकृत. इमेजिंग के लिए, एनए के साथ एक 60x पानी विसर्जन उद्देश्य इस उद्देश्य पहले से इस्तेमाल किया 100X तेल विसर्जन उद्देश्य से एक लंबी दूरी काम है क्योंकि 1.2 इस्तेमाल किया गया था =. उद्देश्य में बढ़ाई में नुकसान की भरपाई करने के लिए, एक अतिरिक्त बढ़ाई लेंस (3.3x या 4.0X) उत्सर्जन पथ में डाला गया था. इसके अलावा, महामारी प्रतिदीप्ति (नहीं TIR) माइक्रोस्कोपी मोटी नमूनों में गहरी क्षेत्रों तक पहुँचने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. यह प जैल में और 2-3 एनएम परिशुद्धता के साथ स्थानीयकृत किया जा सकता खरगोश आंख कॉर्निया (जेड> 200 माइक्रोन) में गहरी लथपथ कि क्वांटम डॉट्स दिखाया गया है.
Protocol
Representative Results
Discussion
फियोना 1 मिसे 4 से 8 नीचे नैनोमीटर परिशुद्धता और अस्थायी समाधान के साथ एक फ्लोरोसेंट emitter (जैविक फ्लोरोफोरे या क्वांटम डॉट) की स्थिति के लिए स्थानीय बनाना एक तकनीक है. पर्याप्त फोटॉनों एकत्र कर रहे हैं…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम एनआईएच अनुदान 068625, NSF अनुदान 1063188 और 0822613. विशेष धन्यवाद खरगोश आँखों के उपहार के लिए उन्नत विज्ञान और प्रौद्योगिकी के लिए Beckman संस्थान में डॉ मरीना Marjanovic के लिए जाना जीवित कोशिकाओं के भौतिकी केंद्र द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Double-sided tape | 3M | — | ~ 75 um thick |
| EMCCD camera | Andor Technology | DU-897E-CS0-#BV | |
| Ultrasonic cleaner | Branson | 2510 | |
| Fluorescence filter set | Chroma | 49016 | |
| Actin polymerization buffer | Cytoskeleton | BSA02 | |
| Biotin G-actin | Cytoskeleton | AB07 | |
| G-actin | Cytoskeleton | AKL95 | |
| General actin buffer | Cytoskeleton | BSA01 | |
| Laser shutter (with driver) | Electro-Optical Products Corp. | SH-10-MP | |
| IDL | Exelis Visual Information Solutions | — | |
| Neutravidin | Fisher Scientific | PI-31000 | |
| Coverslip | Fisherbrand | 22X30-1.5 | 0.16-0.19 mm thick |
| Microscope slide | Gold Seal Microslides | 30103X1 | 0.93-1.05 mm thick |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| Glass bottom dish | In Vitro Scientific | D35-20-1.5-N | |
| Cy3-DNA oligos | Integrated DNA Technologies | — | 5'-Cy3/GCCTCGCTGCCGTCGCCA-3'Bio |
| Fluorescent beads | Invitrogen | T-7280 | |
| Qdot 605-streptavidin | Invitrogen | Q10101MP | |
| Qdot605 | Invitrogen | Q21301MP | |
| Qdot705 | Invitrogen | Q22021MP | |
| Qdot705 Antibody Conjugation Kit | Invitrogen | Q22061MP | |
| Matlab | MathWorks | — | |
| Optical table | Newport Corp | — | RS4000 Series |
| 60X Objective | Nikon | Plan Apo VC 60x WI | |
| 100X Objective | Olympus | PlanApo 100X/1.45 Oil ∞/0.17 | |
| 60X Objective | Olympus | UPlanApo 60X/1.20W | |
| Inverted microscope | Olympus | IX71/IX70/IX81 | |
| Origin | OriginLab | — | |
| Anti-FLAG antibody | Sigma Aldrich | F7425-.2MG | |
| ATP | Sigma Aldrich | A7699 | |
| BME | Sigma Aldrich | 63689-25ML-F | |
| BSA | Sigma Aldrich | A7906 | |
| BSA-biotin | Sigma Aldrich | A8549-10MG | |
| CK | Sigma Aldrich | C3755 | Creatine Phosphokinase from rabbit muscle |
| CP | Sigma Aldrich | P1937 | Phosphocreatine di(tris) salt |
| DTT | Sigma Aldrich | 43815 | DL-Dithiothreitol |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid |
| HCl | Sigma Aldrich | 93363-500G | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H0887 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M1028 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | |
| PCA | Sigma Aldrich | 03930590 | Protocatechuic acid |
| PCD | Sigma Aldrich | P8279 | Protocatechuate-3,4-dioxygenase |
| TMOS | Sigma Aldrich | 341436-25G | Tetramethyl orthosilicate |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | 93363 | |
| Trolox | Sigma Aldrich | 238813 | 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid |
| 1” diameter broadband dielectric mirrors with mounts | Thorlabs | BB1-E02, KM100 | Quantity: 2 |
| ½” diameter posts | Thorlabs | TR4 | Quantity ≥ 6 |
| 10x beam expander | Thorlabs | BE10M-A | |
| 2” diameter broadband dielectric mirrors with mounts | Thorlabs | BB2-E02, KM200 | Quantity: 2 |
| 2” diameter f = 300 mm lens with mount | Thorlabs | LA1256-A, LMR2 | TIR lens |
| Fluorescent alignment target | Thorlabs | VRC2SM1 | |
| Laser safety goggles | Thorlabs | LG3 | |
| ND filter(s) | Thorlabs | FW1AND | |
| Optical beam profiler | Thorlabs | BP209-VIS | |
| Post-mounted iris diaphragm | Thorlabs | ID25 | Quantity: 2 |
| Shearing interferometer | Thorlabs | SI100 | |
| XYZ translation stage, ½” travel | Thorlabs | T12XYZ | |
| Laser | World Star Technologies | TECGL-30 | 532 nm, 30 mW |
References
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