अलगाव, पहचान, और murine Thymic उपकला कोशिकाओं के शोधन
Summary
यहाँ हम अलगाव, पहचान, और माउस Thymic उपकला कोशिकाओं (Tecs) की शुद्धि के लिए एक कुशल विधि का वर्णन. प्रोटोकॉल सामान्य टी सेल विकास, थाइमस रोग, और टी सेल पुनर्गठन के लिए थाइमस समारोह के अध्ययन के लिए उपयोग किया जा सकता है.
Abstract
थाइमस टी लिम्फोसाइट विकास के लिए एक महत्वपूर्ण अंग है. टी सेल प्रतिबद्धता, सकारात्मक चयन और नकारात्मक चयन: Thymic stromal कोशिकाओं की, Thymic उपकला कोशिकाओं (Tecs) टी सेल विकास के कई चरणों में विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैं. हालांकि, थाइमस में Tecs का कार्य अधूरे समझा रहता है. लेख में, हम यांत्रिक विघटन और enzymatic पाचन के संयोजन का उपयोग ताजा माउस थाइमस से टीईसी सबसेट अलग करने के लिए एक विधि प्रदान करते हैं. विधि Thymic stromal कोशिकाओं और thymocytes कुशलतापूर्वक सेल सेल और सेल बाह्य मैट्रिक्स कनेक्शन से जारी होने की और एक एकल कक्ष निलंबन के लिए फार्म की अनुमति देता है. अलग कक्षों का प्रयोग, Multiparameter फ्लो Tecs और वृक्ष के समान कोशिकाओं की पहचान और लक्षण वर्णन करने के लिए लागू किया जा सकता है. Tecs थाइमस में एक दुर्लभ सेल आबादी होते हैं, क्योंकि हम भी समृद्ध और thymocytes, थाइमस में सबसे प्रचुर मात्रा में सेल प्रकार घट द्वारा Tecs शुद्ध करने के लिए एक प्रभावी तरीका वर्णन. Folloसेल व्यवहार्यता की कि नुकसान Tecs की शुद्धि के दौरान कम से कम किया जा सकता है ताकि विंग संवर्धन, सेल छँटाई समय कम किया जा सकता है. शुद्ध कोशिकाओं रीयल टाइम पीसीआर, पश्चिमी धब्बा और जीन अभिव्यक्ति की रूपरेखा की तरह विभिन्न बहाव के विश्लेषण के लिए उपयुक्त हैं. प्रोटोकॉल टीईसी समारोह के अनुसंधान और साथ ही साथ इन विट्रो टी सेल पुनर्गठन के विकास को बढ़ावा देंगे.
Introduction
प्रारंभिक टी सेल के विकास में, अस्थि मज्जा hematopoietic स्टेम सेल व्युत्पन्न multipotent progenitors थाइमस के प्रांतस्था के लिए भर्ती कर रहे हैं, टी वंश के प्रति प्रतिबद्धता से गुजरना और टी सेल व्यापारियों 1 बन जाते हैं. अत्यधिक चर टी सेल रिसेप्टर्स 1 के साथ progenitors के एक बड़े पूल बनाने, प्रांतस्था में, टी सेल अग्रदूत सीडी 4 और सीडी 8 डबल नकारात्मक (डी.एन.) thymocytes विस्तार और अपरिपक्व सीडी 4 और सीडी 8 डबल सकारात्मक (डीपी) thymocytes में अंतर. केवल डीपी कोशिकाओं की एक का चयन MHC-प्रतिबंधित सबसेट, सीडी 4 या सीडी 8 एकल सकारात्मक (सपा) thymocytes बन थाइमस के मज्जा की ओर पलायन, और, कार्यात्मक सक्षम परिपक्व टी कोशिकाओं में सकारात्मक रूप में चयन 2 में निर्दिष्ट है कि एक घटना अलग होगा 6. इसके विपरीत, ऑटो प्रतिक्रियाशील thymocytes के क्लोन नकारात्मक चयन से गुजरना और स्वयं सहिष्णुता के लिए विनियामक टी कोशिकाओं में परिवर्तित, या अभी तक स्पष्ट नहीं हैं कि प्रयोजनों के लिए अंतःउपकला लिम्फोसाइटों के लिए भेज दिया, apoptosis के माध्यम से हटा रहे हैं 3,7-10.
थाइमस में, Thymic stromal कोशिकाओं इन विभिन्न टी सेल विकास भाग्य 5,11,12 के लिए संकेत उपलब्ध कराने के एक अद्वितीय microenvironment रूप में. कॉर्टिकल Tecs (cTECs) और दिमाग़ी Tecs (mTECs), वृक्ष के समान कोशिकाओं, मैक्रोफेज, fibroblasts, endothelial कोशिकाओं, तंत्रिका शिखा व्युत्पन्न pericytes और अन्य mesenchymal कोशिकाओं 13-15 सहित – Thymic stromal कोशिकाओं Thymic उपकला कोशिकाओं (Tecs) से बना रहे हैं. इन के अलावा, Tecs टी सेल विकास 1,2,16,17 के विभिन्न चरणों में महत्वपूर्ण हैं. हालांकि, Tecs अलग करने के लिए एक मजबूत तरीका की कमी के कारण उनके कार्यों 16 की एक व्यापक समझ बाधा उत्पन्न की है. विशेष रूप से, प्रांतस्था में progenitors आसपास के एक तीन आयामी नेटवर्क के रूप में जो cTECs,, अभी तक स्पष्ट नहीं हैं कि कारणों के लिए सकारात्मक चयन 13,18,19 के लिए आवश्यक हैं. इससे पहले के अध्ययनों से ज्यादातर रूपात्मक और ऊतकीय उपकरण 13 पर भरोसा, Tecs की विविधता और भूमिका के रूप में सुराग प्रदान की </sup>. हाल ही में टीईसी कैंपेन्स की अनोखी भूमिकाओं माउस मॉडल 12,20 में आनुवंशिक दृष्टिकोण से संबोधित कर रहे थे. Tecs अलग करने के लिए एक मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य रास्ता cTECs सकारात्मक चयन का समर्थन कैसे टीईसी कैंपेन्स, टीईसी कार्यों की मात्रात्मक और गुणात्मक मूल्यांकन, और तंत्र के स्पष्टीकरण की निष्पक्ष लक्षण वर्णन प्राप्त करने के लिए मौलिक है.
कारण वे बरकरार अंग में फार्म थाइमस में Tecs की दुर्लभता और तंग बातचीत करने के लिए, Tecs के अलगाव चुनौतीपूर्ण हो गया है. यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल पिछले खोजों, वर्तमान में उपलब्ध अभिकर्मकों, तकनीक, और थाइमस संरचना और stromal रचना के ज्ञान पर आधारित है. लगभग दो दशक पहले, कई प्रक्रियाओं trypsin, Collagenase और Dispase सहित विभिन्न एंजाइमों पाचन के दौरान इस्तेमाल किया गया, जिसमें थाइमस ऊतकों 21-27, disaggregate को सूचित किया गया है. ग्रे एट अल. उनके precedure 28 में उन एंजाइमों की तुलना में, और एक बेहतर meth सूचना दीबन गया है कि एंजाइम कॉकटेल 29 की एक कई कदम पाचन के साथ आयुध डिपो व्यापक रूप से 20,30 इस्तेमाल किया. हालांकि, इस पद्धति एक लंबी तैयारी के समय और भी एक ही murine पलटन 29,30 में सेल नंबर और Tecs के अनुपात चर फाइनल में जटिल पाचन कदम और परिणाम शामिल है. कई साल पहले, Liberase अनुसंधान ग्रेड एंजाइम, अत्यधिक Collagenase शुद्ध और तटस्थ प्रोटीज थाइमस ऊतक हदबंदी 30 में इस्तेमाल किया जा करने के लिए शुरू कर दिया युक्त. यहाँ, हम माउस थाइमस ऊतकों से व्यवहार्य Tecs की एक उच्च संख्या कि पैदावार अनुकूलित यांत्रिक जुदाई प्रक्रियाओं के साथ एक Liberase पाचन आधारित प्रोटोकॉल, का वर्णन. .
अलग stromal कोशिकाओं को समृद्ध करने के लिए, पिछले अध्ययनों घनत्व ढ़ाल या चुंबकीय मनका जुदाई 21,29 या तो इस्तेमाल किया है. हालांकि, दोनों तरीकों Thymic stromal कोशिकाओं, cTECs 29 की विशेष रूप से जनसंख्या की कुछ आबादी के खो गंभीर कारण. साइटोटोक्सिक उन्मूलन और panning तकनीक <s> 31,32 ऊपर व्यापक रूप से प्रतिरक्षा क्षेत्र 12,31 में कमी या लिम्फोसाइटों के विभाजन के लिए इस्तेमाल किया गया है. इन तकनीकों की तुलना करने के बाद, हम Tecs के संवर्धन के लिए वर्तमान पैनिंग प्रोटोकॉल की स्थापना की. संवर्धन प्रक्रिया के दौरान कोमल हालत कम कोशिका मृत्यु और निष्पक्ष और बढ़ टीईसी वसूली की ओर जाता है.
धारा 3 में वर्णित पृथक थाइमस सेल निलंबन सीधे टीईसी कैंपेन्स और वृक्ष के समान कोशिकाओं की पहचान और लक्षण वर्णन के लिए cytometric विश्लेषण प्रवाह करने के लिए लागू किया जा सकता है. धारा 4 कोशिकामापी Multiparameter प्रवाह का उपयोग टीईसी सबसेट की पहचान करने के लिए एक सरल और उपयोगी तरीका वर्णन करता है. शुद्ध cTECs या mTECs, टीईसी संवर्धन और प्रक्रियाओं छँटाई सेल प्राप्त करने की तलाश है कि प्रयोगों के लिए धारा 5 और 6 में पाया जा सकता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम थाइमस stromal कोशिकाओं (धारा 3) की तैयारी और Tecs के संवर्धन (धारा 4) हैं. यह जोरदार ताजा एंजाइम समाधान हर समय तैयार है और ऊतकों के रूप में जल्द से जल्द इलाज किया जाता है की सिफारिश की ह…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम (काह को) स्वास्थ्य अनुदान R01 AI088209 के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया. हम भी मिनेसोटा फ्लो संसाधन विश्वविद्यालय धन्यवाद.
Materials
| Anti-mouse EpCAM | eBioscience | XX-5791-YY* | Clone G8.8 |
| Anti-mouse MHC II | eBioscience | XX-5321-YY* | Clone M5/114.15.2 |
| Anti-mouse Ly51 | eBioscience | XX-5891-YY* | Clone 6C3 |
| UEA-1 | Vector Laboratory | FL-1061 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | LSRFortessa | |
| Flow cell sorter | BD Biosciences | FACSAria | |
| FACS tubes | BD Biosciences | 352052 | |
| Flow cytometry analysis software | TreeStar – Flowjo | FlowJo v7/9 | |
| *XX varies by fluorochrome and YY varies by vial size. |
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