Isolasjon, Identifikasjon, og rensing av Muse thymisk Epitelceller

Summary

Her beskriver vi en effektiv metode for isolering, identifisering, og rensing av mus thymisk epitelceller (TECS). Protokollen kan benyttes for studier av thymus-funksjon for normal T-celle utviklingen, thymus dysfunksjon, og T-celle rekonstituering.

Abstract

Thymus er et viktig organ for T-lymfocytter utvikling. Av thymus stromale celler, thymus epitelceller (TECS) er spesielt viktig på flere stadier av T celle utvikling: T celle engasjement, positiv utvelgelse og negativ seleksjon. Men forblir funksjonen TECS i thymus ufullstendig forstått. I artikkelen gir vi en metode for å isolere TEC undergrupper fra friske mus thymus ved hjelp av en kombinasjon av mekanisk avbrudd og enzymatisk fordøyelse. Fremgangsmåten gjør det mulig for thymus stromale celler og thymocytter effektivt skal frigjøres fra celle-celle og celle-ekstracellulær matriks-forbindelser, og for å danne en enkelt-cellesuspensjon. Ved hjelp av de isolerte celler, kan multiparameter flowcytometri anvendes til identifisering og karakterisering av TECS og dendrittiske celler. Fordi TECS er en sjelden cellepopulasjon i thymus, vi også beskrive en effektiv måte å berike og rense TECS ved tappe thymocytter, den mest tallrike celletype i thymus. Follovinge anrikning, cellesortering Tiden kan bli redusert, slik at tap av cellelevedyktighet kan minimeres ved rensing av TECS. Purified celler er egnet for ulike nedstrøms analyser som Real Time-PCR, Western blot og genuttrykk profilering. Protokollen vil fremme forskning av TEC-funksjon og så vel som utvikling av in vitro T-celle rekonstituering.

Introduction

Tidlig i T celle utvikling, er beinmargsstamcelle-avledet multipotente stamceller rekruttert til cortex i thymus, gjennomgå satsing på T avstamning og bli T-celle forløpere ^en. I cortex, T-celle forløper CD4 og CD8 double negative (DN) thymocytter utvide og differensieres til umoden CD4 og CD8 dobbel positive (DP) thymocytter, danner en stor pool av stamfedre med svært variabel T celle reseptorer ^en. Bare en velger MHC-begrenset undergruppe av DP-celler blir CD4-eller CD8-positive enkelt (SP) thymocytter, migrere til medulla av thymus, og differensiere i kompetente funksjonelt modne T-celler, en hendelse som er referert til som positiv utvelgelse ^{2- 6.} I kontrast, kloner av auto-reaktivt thymocytter gjennomgå negativ seleksjon og fjernes via apoptose, konvertert til regulatoriske T-celler for selv toleranse, eller viderekoblet til intraepitelial lymfocytter til formål som er ennå ikke klart ^3,7-10.

I thymus, thymus stromale cellene danner et unikt mikromiljøet signaler tilbake til disse ulike T celle utvikling skjebner ^5,11,12. Thymisk stromale celler er sammensatt av thymus epitelceller (TECS) – inkludert cortical TECS (cTECs) og marg TECS (mTECs), dendrittiske celler, makrofager, fibroblaster, endotelceller, neural crest-avledet pericytes og andre mesenchymalceller ^13-15. Blant disse TECS er avgjørende på de ulike stadier av T celle utvikling ^1,2,16,17. Imidlertid har mangelen på en robust måte å isolere TECS hemmet en omfattende forståelse av deres funksjoner ^16. Spesielt cTECs, som danner et tredimensjonalt nettverk som omgir progenitorer i cortex, er essensielle for positiv utvelgelse ^13,18,19 av grunner som ennå ikke er klar. Tidligere studier gitt ledetråder som er heterogen og rolle TECS, for det meste avhengig av morfologiske og histologiske verktøy ¹³ </sup>. Nylig de unike roller TEC undergrupper ble behandlet av genetiske metoder i musemodeller ^12,20. En robust og reproduserbar måte å isolere TECS er grunnleggende for å oppnå objektiv karakterisering av TEC undergrupper, kvantitativ og kvalitativ vurdering av TEC funksjoner, og avklaring av mekanismene hvordan cTECs støtte positiv utvelgelse.

På grunn av lav TECS i thymus og stramme interaksjoner de danner i intakt organ, har isolering av TECS vært utfordrende. Protokollen er beskrevet her er basert på tidligere funn, for tiden tilgjengelig reagenser, teknikker og kunnskap om thymus struktur og stromal sammensetning. Nesten to tiår siden, ble flere prosedyrer rapportert å disaggregert thymus vev ^21-27, der ulike enzymer ble brukt under fordøyelsen, inkludert Trypsin, Kollagenase og dispase. Gray et al. sammenlignet disse enzymer i deres precedure ^28, og rapporterte en forbedret method med en flere-trinns fordøyelsen av enzym cocktails ²⁹ som ble mye brukt ^20,30. Imidlertid innebærer denne metoden en lang forberedelsestid og komplekse fordøyelsen trinn og resultater i variabel endelige celle tall og andeler av TECS selv i samme murine kohort ^29,30. For flere år siden, Liberase forskning grade enzym, som inneholder høyt renset Kollagenase og nøytral protease begynte å bli brukt i thymus vev dissosiasjon ^30.. Her beskriver vi en Liberase fordøyelsen-basert protokoll, med optimaliserte mekaniske separasjonsprosedyrer, som gir et høyt antall av levedyktige TECS fra mus thymus vev. .

Å berike dissosiert stromale celler, har tidligere studier brukes enten tetthetsgradienter eller magnetiske kuler separasjon ^21,29. Men begge metodene forårsake alvorlig mistet av visse populasjoner av thymus stromale celler, særlig befolkningen i cTECs ^29. Cytotoksiske eliminasjon og panorering teknikker <sopp> 31,32 har blitt utbredt benyttet for uttømming eller separasjon av lymfocytter i den immunologiske felt ^12,31. Etter sammenligning av disse teknikkene, etablerte vi dagens panorering protokoll for anriking av TECS. Den milde tilstand under berikelse prosedyren fører til mindre celledød og saklig og økt TEC utvinning.

Det isolerte thymus cellesuspensjon som er beskrevet i avsnitt 3 kan direkte brukes til å flowcytometrisk analyse for identifikasjon og karakterisering av TEC-undergrupper og dendrittiske celler. § 4 beskriver en enkel og nyttig måte å identifisere TEC undergrupper ved hjelp av multiparameter flowcytometer. For eksperimenter som søker å oppnå renset cTECs eller mTECs, TEC berikelse og celle sortering prosedyrer finnes i kapittel 5 og 6.

Protocol

I denne studien, voksen – ble (6 8 uker) kvinnelige C57BL / 6 mus brukes. Mus ble kjøpt fra National Cancer Institute og vedlikeholdt under spesifikke patogen frie forhold. The University of Minnesota Institutional Animal Care og bruk komité (IACUC) godkjent all dyreforsøk. 1. Utarbeidelse av instrumenter og buffere Forbered enzymløsning (RPMI1640 medium med 0,05% [w / v] over Liberase TH og 100 U / ml DNase I), albumin-rike buffer (1X PBS [2 + Ca / Mg 2 +-fri]…

Representative Results

Ved hjelp av denne fremgangsmåte ble en thymus organ fjernet fra en voksen mus (del 2) og en thymisk cellesuspensjon ble fremstilt som beskrevet i del 3. Den oppnådde cellesuspensjon besto av thymocytter, hematopoetiske-avledet stromale celler og ikke-hematopoietiske stromale celler. CD45 er et hematopoietisk pan-markør uttrykt på begge thymocytter og hematopoetiske stromale celler slik som makrofager og dendrittiske celler. I kontrast, TECS er ikke av blodkreft opprinnelse og ikke uttrykker CD45 15. Cell…

Discussion

I protokollen, kritiske trinn er utarbeidelse av thymus stromale celler (§ 3) og berikelse av TECS (§ 4). Det anbefales sterkt at frisk enzymløsning fremstilles hver gang, og vevet blir behandlet så snart som mulig. For sammenslåtte Thymi, er å optimalisere mengden av enzym-oppløsningen som kreves avhengig av antall Thymi. Hvis en vevet rester som er igjen etter behandlingen, kan legge mer enzymløsning og forlengelse av inkubasjonstiden øke celleutbytte. Ved anrikning av TECS, full samling av supernatanten og ?…

Materials

Anti-mouse EpCAM	eBioscience	XX-5791-YY*	Clone G8.8
Anti-mouse MHC II	eBioscience	XX-5321-YY*	Clone M5/114.15.2
Anti-mouse Ly51	eBioscience	XX-5891-YY*	Clone 6C3
UEA-1	Vector Laboratory	FL-1061
Flow cytometer	BD Biosciences	LSRFortessa
Flow cell sorter	BD Biosciences	FACSAria
FACS tubes	BD Biosciences	352052
Flow cytometry analysis software	TreeStar – Flowjo	FlowJo v7/9
*XX varies by fluorochrome and YY varies by vial size.