Гидрогель наночастиц Заготовка плазмы или мочи для обнаружения Низкие Белки изобилии
Summary
Several pathological biomarkers cannot be easily detected by current techniques because of their low concentration in biological fluids, the presence of degrading enzymes, and large amounts of high molecular weight proteins. Chemically functionalized hydrogel nanoparticles can harvest, preserve and concentrate low abundance proteins enabling the detection of previously undetectable biomarkers.
Abstract
Роман поиска биомаркеров играет решающую роль в обеспечении более чувствительным и специфичным обнаружению болезни. К сожалению, многие низкой численности биомаркеров, которые существуют в биологических жидкостях, не могут быть легко обнаружены с масс-спектрометрией или иммунологических, потому что они присутствуют в очень низкой концентрации, лабильны, и часто замаскированных высокой численности белки, такие как альбумин или иммуноглобулин. Приманка, содержащий поли (N-изопропилакриламид) (NIPAm) наночастицы на основе способны преодолеть эти физиологические барьеры. В одном шаге они способны захватить, сосредоточиться и сохранить биомаркеров из жидкостей организма. Низкомолекулярные анализируемые вес введите ядро наночастицы и захвачены различных органических химических красителей, которые действуют как высокоаффинные белковых приманок. Наночастицы способны концентрировать белки интересов на несколько порядков. Этот коэффициент концентрации достаточно, чтобы повысить уровень белка таким образом, что белки находятся в пределахПредел обнаружения текущих масс-спектрометров, вестерн-блоттинга и иммунологических. Наночастицы могут быть инкубировали с множеством биологических жидкостях, и они способны значительно обогатить концентрацию белков и пептидов с низкой молекулярной массой, исключая альбумин и другие белки с высоким молекулярным весом. Наши данные показывают, что 10000 раз усиление в концентрации конкретного анализируемого вещества может быть достигнуто, позволяя масс-спектрометрии и иммунологические анализы для обнаружения ранее неопределяемый биомаркеров.
Introduction
Несмотря на завершение в ДНК генома человека, значительный прогресс не был достигнут в идентификации биомаркеров, прогнозирования ранних стадиях заболевания, или, что коррелирует с терапевтического результата, или прогноза 1. Одной из причин такого отсутствия прогресса в том, что многие потенциально значительные биомаркеры существуют в концентрации ниже предела обнаружения обычной масс-спектрометрии и других платформ поиска биомаркеров. Масс-спектрометрия (МС) и множественный Мониторинг реакции (МРМ) имеют чувствительность обнаружения обычно больше, чем 50 нг / мл, а большинство анализируемых веществ измеряется с помощью иммуноанализа в клинической лаборатории падения в пределах от 50 пг / мл и 10 нг / мл . Это означает, что многие биомаркеры, особенно в начальной стадии болезни, не могут быть обнаружены с помощью обычного МС и MRM 2. Кроме того наличие высокого обилия белков, таких как альбумин и иммуноглобулин в сложных биологических жидкостей часто маскируют путем млрд раза отлESS низкой численности, низкомолекулярные белки и пептиды 3, 4. По этой причине несколько образцов подготовительные шаги необходимо перед масс-спектрометрии секвенирования и идентификации. Одним из таких подготовительным шагом использует истощение высокого обилия белков с коммерчески доступных истощения столбцов 5-8. К сожалению, этот шаг приводит к снижению выхода кандидатов биомаркеров, потому что они часто не ковалентно связаны с белками-носителями, которые удаляются. Еще одна проблема представлена стабильности кандидатов биомаркеров экс-Vivo после того, как образцы собираются. Белки подвержены деградации эндогенных или экзогенных протеаз 9. Гидрогелевые наночастицы могут преодолеть эти критические проблемы путем амплификации предполагаемого концентрацию биомаркеров до уровня в интервале анализа, при одновременной защите от деградации белка 10-13.
Важно отметить йна LMW белков в крови представляют собой смесь мелких интактных белков, а также фрагменты больших белков. Тканевые происхождения белки больше, чем 60 кДа слишком велики, чтобы пассивно проникать в кровеносную систему через базальную мембрану сосудов, но они могут быть представлены в кровь в виде пептидов или белковых фрагментов 14. Наша цель заключается в измерении новых циркулирующих биомаркеров, которые могут быть кандидатами для раннего выявления заболевания, стратификации пациентов для терапии, и мониторинга ответа на терапию. Наши наночастицы создаются, чтобы выборочно исключить высокое содержание иммуноглобулины и альбумин, в то же время захвата меньшие белки и пептиды, и их концентрации до 100-кратного в зависимости от исходного объема.
Наша группа определила набор небольших органических красителей, которые могут успешно действовать как высокоаффинные молекулярные приманки для белков и пептидов. Белок-краситель связывания, как полагают, обусловлено сочетанием гидрофобных и электростатическим взаимодействиемс. Ароматические кольца на красителе чередовать с белками через гидрофобных карманов на поверхности белка 11.
Приманки, в зависимости от их химии, показывают особое сродство для выбранных классов веществ. Приманки конкурировать с белками-носителями, такими как альбумин, для белков или пептидов. В низкомолекулярные белки / пептиды в ловушку частицы. С высокой молекулярной массой белки, такие как альбумин и иммуноглобулина предотвратить попадание частицы в связи с возможностью просеивания в связи с ограничительной поры гидрогеля 11 (рисунок 1).
Гидрогелевые наночастицы синтезируют полимеризацией, инициированной осадков персульфата аммония 11. N-изопропилакриламид (NIPAm), со-мономеров акриловой кислоты (AAC) и аллиламина (АА) и сшивающего агента N, N'-метиленбисакриламид (BIS) подвергают взаимодействию при 70 ° С в течение 6 ч в разбавленных условиях 11, 13. Связывание с высоким содержанием белка сродство поли (N-изопропилакриламид-CO-акриловой кислоты) (поли (NIPAm-CO-AAC) nanoparticlesis достигнуто путем ковалентного включающий аминокислоты, содержащие красители (т.е.., Sulfonatedanthraquinonetriazine красители) в наночастицах с помощью амидирование реакцию проводят в водных или органических растворителей в зависимости от гидрофильных / гидрофобных характеристик красителей 11, 13. нуклеофильного замещения аминогрупп в наночастицы с атомом хлорида из anthraquinonetriazine красителя используется для создания красителей, содержащих поли (NIPAm оо-Аллиламин) (AA) наночастиц 11, 12. процесс двухступенчатый полимеризации используется для создания гидрогеля наночастицы, содержащие внешнюю оболочку винилсульфокислота (VSA) 11, 13.
Гидрогелевые наночастицы могут быть применены в различных биологических жидкостей, в том числе цельной крови, плазмы, сыворотки, цереброспинальной жидкости, пота, мочи и. В один шаг, в растворе, нanoparticles выполнить быстрое (в течение минут) улавливание и концентрации с низкой молекулярной массой аналиты 10, 11, 13, 15-18. Белки затем элюируют из наночастиц, и обнаружить с помощью Вестерн-блоттинга 19-21, масс-спектрометрии 10, 11, 13, 15, 18, 22, 23, иммунологические / ELISA, 10, 11, 15, 18, или с обращенной фазой белок микрочипов 16, 24 анализы. Наночастицы функционализирован химической приманки, и представления основной или архитектуру ядра оболочки, захват и сосредоточиться белки, основанные на свойствах физико приманки / оболочка. Поэтому различные красители, использовавшиеся для наночастиц будет фиксировать различные подмножества белков с различной эффективностью на основе близости красителя, рН раствора, и наличие / отсутствие конкурирующих высокие-изобилии белки 13. Кроме того, количество наночастиц по отношению к объему раствора влияет на выход белка из наночастиц. Эти аспектыГидрогель заготовки наночастиц продемонстрированы с использованием трех различных приманок наночастиц для уборки белков из образцов плазмы, которые содержат большое количество белка, и от образцов мочи, которые обычно не содержат большое количество белка. В этом протоколе мы продемонстрировать сбор и концентрации фактора некроза опухолей альфа (ФНО) из образцов плазмы с использованием поли (NIPAm-CO-AAC), поли (NIPAm / краситель), и наночастицы core- оболочки (поли (NIPAm-CO-VSA)) . Поли (NIPAm / краситель) наночастицы показано сосредоточиться Mycobacterium видовой антиген, который был добавлен в образцах мочи человека, чтобы имитировать микобактерий туберкулеза инфицированных людей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Клиническое значение
Сыворотки или плазмы, как полагают, содержат низким изобилие циркулирующей белки и пептиды, которые могут обеспечить богатый источник информации о состоянии организма в целом. Несмотря на обещание сыворотки протеомики, существуют три осн…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Майкл Генри, Dublin City University, любезно помогал с сбора и анализа данных, показанной на рисунке 5. Эта работа была частично поддержана (1) Университет Джорджа Мейсона, (2) итальянская IstitutoSuperiore ди Санита »в рамках Италия / США Соглашение о сотрудничестве между Министерством здравоохранения и социальных служб, Университете Джорджа Мэйсона, и итальянским министерством здравоохранения, (3) NIH, IMAT программы грантов 1R21CA137706-01 и 1R33CA173359-01 в LAL, и (4) Ceres нанонаукам, Inc .
Materials
| hydrogel nanoparticles | Ceres Nanoscience | CS003 | NanoTrap ESP particles |
| 18 MΩ-cm water | Type 1 reagent grade water | ||
| Tris HCl, 50mM pH7.0 | VWR | IC816116 | 50mM, pH 7 |
| Acetonitrile | BDH | BDH1103-4LP | available from VWR |
| Ammonium Hydroxide NH4OH | BDH | BDH3014 | available from VWR, assayed at 28-30% NH3 |
| sodium thiocyanate 25mM | Acros Organics | 419675000 | for serum/plasma samples |
| Multi-analyte Urine Reagent Strips | Siemens | 2161 | for urine samples |
| Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X) | Life Technologies | LC2676 | use at room temperature to prevent SDS from precipitating |
| Dry bath incubator (100 oC) with heating block | Barnstead | 11-715-125DQ | do not substitute a boiling water bath |
| Nitrogen evaporator manifold | Organomation Associates | Microvap118 | for serum/plasma samples |
| Centrifuge, swing-out rotor | Sorvall | Legend series | 50ml tube capacity, rcf 3700 x g |
| Centrifuge, fixed angle rotor | Eppendorf | 5424 | 1.7ml microcentrifuge capacity, rcf 16,000 x g |
| 50ml conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | with screw caps for urine samples |
| 1.5ml microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22363204 | |
| Disposable plastic transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | at least 1ml capacity |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 50-949-755 | |
| Timer | Fisher Scientific | S04782 | seconds/minutes |
References
- Aebersold, R., Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature. 422 (6928), 198-207 (2003).
- Gerszten, R. E., et al. Challenges in translating plasma proteomics from bench to bedside: update from the NHLBI Clinical Proteomics Programs. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 295 (1), L16-L22 (2008).
- Merrell, K., et al. Analysis of low-abundance, low-molecular-weight serum proteins using mass spectrometry. J Biomol Tech. 15 (4), 238-248 (2004).
- Petricoin, E. F., Belluco, C., Araujo, R. P., Liotta, L. A. The blood peptidome: a higher dimension of information content for cancer biomarker discovery. Nat Rev Cancer. 6 (12), 961-967 (2006).
- Camerini, S., Polci, M. L., Liotta, L. A., Petricoin, E. F., Zhou, W. A method for the selective isolation and enrichment of carrier protein-bound low-molecular weight proteins and peptides in the blood. Proteomics Clin Appl. 1 (2), 176-184 (2007).
- Geho, D., et al. Fractionation of serum components using nanoporous substrates. Bioconjug Chem. 17 (3), 654-661 (2006).
- Sennels, L., et al. Proteomic analysis of human blood serum using peptide library beads. J Proteome Res. 6 (10), 4055-4062 (2007).
- Zheng, X., Baker, H., Hancock, W. S. Analysis of the low molecular weight serum peptidome using ultrafiltration and a hybrid ion trap-Fourier transform mass spectrometer. J Chromatogr A. 1120 (1-2), 173-184 (2006).
- Marshall, J., et al. Processing of serum proteins underlies the mass spectral fingerprinting of myocardial infarction. J Proteome Res. 2 (4), 361-372 (2003).
- Fredolini, C., et al. Concentration and Preservation of Very Low Abundance Biomarkers in Urine, such as Human Growth Hormone (hGH), by Cibacron Blue F3G-A Loaded Hydrogel Particles. Nano Res. 1 (6), 502-518 (2008).
- Luchini, A., et al. Smart hydrogel particles: biomarker harvesting: one-step affinity purification, size exclusion, and protection against degradation. Nano Lett. 8 (1), 350-361 (2008).
- Patanarut, A., et al. Synthesis and characterization of hydrogel particles containing Cibacron Blue F3G-A. Colloids Surf A Physicochem Eng Asp. 362 (1-3), 8-19 (2010).
- Tamburro, D., et al. Multifunctional core-shell nanoparticles: discovery of previously invisible biomarkers. J Am Chem Soc. 133 (47), 19178-19188 (2011).
- Anderson, N. L., Anderson, N. G. The human plasma proteome: history, character, and diagnostic prospects. Mol Cell Proteomics. 1 (11), 845-867 (2002).
- Fredolini, C., et al. Nanoparticle technology: amplifying the effective sensitivity of biomarker detection to create a urine test for hGH. Drug Test Anal. 1 (9-10), 447-454 (2009).
- Longo, C., et al. Core-shell hydrogel particles harvest, concentrate and preserve labile low abundance biomarkers. PLoS One. 4 (3), e4763 (2009).
- Luchini, A., et al. Nanoparticle technology: addressing the fundamental roadblocks to protein biomarker discovery. Curr Mol Med. 10 (2), 133-141 (2010).
- Luchini, A., et al. Application of Analyte Harvesting Nanoparticle Technology to the Measurement of Urinary HGH in Healthy Individuals. J Sports Med Doping Stud. 2 (6), (2012).
- Eslami, A., Lujan, J., Western, blotting: sample preparation to detection. J Vis Exp. (44), (2010).
- Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. J Vis Exp. (16), (2008).
- Penna, A., Cahalan, M., , Western Blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels. J Vis Exp. (7), 264 (2007).
- Bosch, J., et al. Analysis of urinary human growth hormone (hGH) using hydrogel nanoparticles and isoform differential immunoassays after short recombinant hGH treatment: preliminary results. J Pharm Biomed Anal. 85, 194-197 (2013).
- Fredolini, C., et al. Investigation of the ovarian and prostate cancer peptidome for candidate early detection markers using a novel nanoparticle biomarker capture technology. AAPS J. 12 (4), 504-518 (2010).
- Longo, C., et al. A novel biomarker harvesting nanotechnology identifies Bak as a candidate melanoma biomarker in serum. Exp Dermatol. 20 (1), 29-34 (2010).
- Luchini, A., Longo, C., Espina, V., Petricoin, E. F., Liotta, L. A. Nanoparticle technology: Addressing the fundamental roadblocks to protein biomarker discovery. J Mater Chem. 19 (29), 5071-5077 (2009).
- Douglas, T. A., et al. The use of hydrogel microparticles to sequester and concentrate bacterial antigens in a urine test for Lyme disease. Biomaterials. 32 (4), 1157-1166 (2010).
- Prakash, A., et al. Interlaboratory reproducibility of selective reaction monitoring assays using multiple upfront analyte enrichment strategies. J Proteome Res. 11 (8), 3986-3995 (2012).
- Choi, K. M., et al. Implication of lipocalin-2 and visfatin levels in patients with coronary heart disease. Eur J Endocrinol. 158 (2), 203-207 (2008).
- Hughes, A. D., Clunn, G. F., Refson, J., Demoliou-Mason, C. Platelet-derived growth factor (PDGF): actions and mechanisms in vascular smooth muscle. Gen Pharmacol. 27 (7), 1079-1089 (1996).
- Izycki, T., et al. Serum levels of IGF-I and IGF-II in patients with lung cancer during chemotherapy. Exp Oncol. 26 (4), 316-319 (2004).
- Jalosinski, M., Karolczak, K., Mazurek, A., Glabinski, A. The effects of methylprednisolone and mitoxantrone on CCL5-induced migration of lymphocytes in multiple sclerosis. Acta Neurol Scand. 118 (2), 120-125 (2008).
- Kitazume, S., et al. Molecular insights into beta-galactoside alpha2,6-sialyltransferase secretion in vivo. Glycobiology. 19 (5), 479-487 (2009).
- Saito, T., et al. Increase in hepatic NKT cells in leukocyte cell-derived chemotaxin 2-deficient mice contributes to severe concanavalin A-induced hepatitis. J Immunol. 173 (1), 579-585 (2004).
- Struyf, S., et al. PARC/CCL18 is a plasma CC chemokine with increased levels in childhood acute lymphoblastic leukemia. Am J Pathol. 163 (5), 2065-2075 (2003).
- Michael, I. P., et al. Human tissue kallikrein 5 is a member of a proteolytic cascade pathway involved in seminal clot liquefaction and potentially in prostate cancer progression. J Biol Chem. 281 (18), 12743-12750 (2006).
