Kültürleme<em> Caenorhabditis elegans</em > Mikroparçacık bombardımanı ile aksenik Sıvı Medya ve Transgenik Worms Yaratılış
Summary
C. elegans genellikle katı agar plakaları üzerinde büyütülmüş ve sıvı kültürlerde E ile tohumlanır coli. Toksikolojik ve beslenme çalışmaları karıştırıcı bakteriyel yan ürünleri önlemek için, biz aşağı bir uygulama yelpazesi için solucanlar çok sayıda büyümeye ve senkronize etmek için, bir aksenik sıvı ortam, CeHR kullanılmaktadır.
Abstract
Bu protokol, biz gerekli malzemeleri mevcut, ve modifiye C yapmak için prosedür. E Legans Alışma ve Üreme medya (mCeHR). Ayrıca, C teşhir ve acclimatizing için adımlar E. yetiştirilen elegans sıvı ortam aksenik coli açıklanmaktadır. Aksenik C kullanmaktadır Son olarak, alt-deneyler elegans Bu işlemin yararlarını gösterir. C analiz ve tespit yeteneği elegans besin gereksinimi değişen heme konsantrasyonları ile aksenik sıvı ortamda N2 yabani tip solucanlar büyüyen tarafından izah edildi. Bu prosedür, solucan büyüme ve gelişme için optimal konsantrasyonunu belirlemek için ya da ilaç tedavilerinin toksikolojik etkisini saptamak için söz konusu besin ile çoğaltılabilir. Yabani tip solucanlar büyümesi üzerinde çeşitli heme konsantrasyonlarının etkisi niteliksel mikroskopik gözlem yoluyla ve t ölçülmesi ile tespit edilmiştirHer bir heme konsantrasyonda büyüme solucanlar O sayısı. Buna ek olarak, çeşitli besin konsantrasyonlarının etkisi, ilgi konusu besin değişikliklere yanıt floresan sensörler ifade solucan kullanılarak analiz edilebilir. Ayrıca, solucan, çok sayıda mikro-parçacık bombardımanı ile kolayca transgenik C. elegans üretimi için üretilmiştir.
Introduction
Toprak nematod, Caenorhabditis elegans, toksikoloji genetikten çok sayıda çalışmalarda kullanılan güçlü bir model organizmadır. Bu 1 mm boyutu, dört gün, yetiştirme kolaylığı, hızlı bir üretim süresi ve büyük döl numaralarının bir sonucu olarak, bu nematodlar genetik ve farmakolojik ekranlar, 1, 2, bir dizi olarak kullanılmıştır. Araştırmacılar omurgalı sistemlerinde muhafaza molekülleri ve yolları belirlemek için bu solucanın yararlanmak. Bu yollar hücre ölümü sinyalleri, yaşlanma ve metabolizma yolları ve sinir sistemini 3-6 arasındadır. Buna ek olarak, C şeffaflık elegans doğrudan gen ekspresyonu ve protein lokalizasyonu analiz etmek görselleştirilebilir floresan protein muhabir kullanılarak transjenik nesil için izin verir.
Birçok çalışmada bu nematod nematod büyüme ortamı (NGM) plakalar kullanılarak, bir katı agar-bazlı bir yüzeye veya l kültürlenirJK monitörler kültürler bir besin kaynağı olarak 7,8 Escherichia coli ile tohumlandı. Bu bakteri gıda kaynakları tarafından ürünlerin sonuçların yorumlanmasını etkileyen bakteriyel müdahalesi ile biyokimyasal ve toksikoloji çalışmaları karıştırabilir. , C. Bu bileşik etkileri önlemek için, elegans bir besin kaynağı olarak bakteri yoksun olan bir aksenik sıvı ortam içinde kültive edilebilir. Bu medyayı kullanarak, başarılı birçok standart C için son derece senkronize solucan milyonlarca kültüre C. farklı olarak düzenlenen genlerin dahil olmak üzere, mikro-dizi analizi elegans protokolleri elegans heme farklı konsantrasyonlarına maruz bırakılır ve gen bombardımanı ile transgenik solucanlar üretimi. Bu ortam, kimyasal olarak tanımlanmış ve Dr Eric Clegg 9 formüle orijinal bir reçete modifiye edilir. Bu mCeHR medyayı kullanarak, başarılı heme homeostazda ilgili genleri tespit ettik, 10 (hrg ler) olarak heme duyarlı genlerin ifade yönelecekE ile ekim yapılmış olan NGM agar plakalar kullanmak normal büyüme koşullarında mümkün olmamıştır coli.
Bu protokolde C tanıtmak ve korumak için prosedürü tarif E. yetiştirilen elegans coli aksenik mCeHR ve transgenik C üretmek için solucan çok sayıda elde etmek için bu yöntem kullanmak mikro-parçacık bombardımanı kullanılarak elegans hatları. C beslenme gereksinimini belirlemek için aksenik medyayı kullanmanın yararını göstermektedir biz de mevcut çalışmalar elegans bir örnek olarak heme kullanılmıştır. Bu çalışmalar mCeHR medya kullanarak C arasındaki bir sayıda hızlı büyüme sağlar olduğunu göstermektedir solucan araştırmacılar tarafından kullanılan birçok downstream uygulamalar için elegans.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokolde hızlı C. sağlayan bir modifiye aksenik sıvı medya mCeHR sunmak solucanlar, çok sayıda üretim elegans üretimi. Solucanlar E. kirletmeden yetişir gibi bu ortam birçok avantajları göstermektedir coli veya bakteriyel yan ürünleri ve beslenme ve toksikolojik çalışmalar istismar edilebilir. E. kullanılması E. coli ya da bu tür çalışmalarda diğer bakterilerin çeşitli dezavantajları vardır. Örneğin, bakterilerin büyümesi çeşit…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma HealthGrants DK85035 ve DK074797 (İH) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir.
Materials
| MgCl2.6H2O | Sigma | M-2393 | |
| Sodium citrate | Sigma | S-4641 | |
| Potassium citrate.H2O | Sigma | P-1722 | |
| CuCl2.2H2O | Fisher | C455-500 | |
| MnCl2.4H2O | Fisher | M87-100 | |
| ZnCl2 | Sigma | Z-0152 | |
| Fe(NH4)2(SO4)2.6H2O | Sigma | F-1018 | |
| CaCl2.2H2O | Fisher | C70-500 | |
| Adenosine 5 -monophosphate, sodium salt | Sigma | A-1752 | |
| Cytidine 5 -phosphate | Sigma | C-1006 | |
| Guanosine 2 – and3 -monophosphate | Sigma | G-8002 | |
| Uridine 5 -phosphate, disodium salt | Sigma | U-6375 | |
| Thymine | Sigma | T0376 | |
| N-Acetylglucosamine | Sigma | A3286 | |
| DL-Alanine | Fisher | S25648 | |
| p-Aminobenzoic Acid | Sigma | A-9878 | |
| Biotin | Sigma | B-4639 | |
| Cyanocobalamine (B-12) | Sigma | V-2876 | |
| Folinate (Ca) | Sigma | F-7878 | |
| Niacin | Sigma | N-0761 | |
| Niacinamide | Sigma | N-3376 | |
| Pantetheine | Sigma | P-2125 | |
| Pantothenate (Ca) | Sigma | P-6292 | |
| Pteroylglutamic Acid (Folic Acid) | ACRCS | 21663-0100 | |
| Pyridoxal 5'-phosphate | Sigma | P-3657 | |
| Pyridoxamine.2HCl | Sigma | P-9158 | |
| Pyridoxine.HCl | Sigma | P-6280 | |
| Riboflavin 5-PO4(Na) | Sigma | R-7774 | |
| Thiamine.HCl | Sigma | T-1270 | |
| DL-6,8-Thioctic Acid | Sigma | T-1395 | |
| KH2PO4 | Sigma | P-5379 | |
| Choline di-acid citrate | Sigma | C-2004 | |
| myo-Inositol | Sigma | I-5125 | |
| D-Glucose | Sigma | G-7520 | |
| Lactalbumin enzymatic hydrolysate | Sigma | L-9010 | |
| Brain Heart Infusion | BD | 211065 | |
| Hemin chloride | Frontier Scientific | H651-9 | |
| HEPES, Na salt | Sigma | H-3784 | |
| Cholesterol | J.T. Baker | F676-05 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 11140-076 | |
| MEM Amino Acids Solution | Invitrogen | 11130-051 | |
| Nalidixic acid sodium salt | Sigma | N4382 | |
| Tetracycline Hydrochloride | MP Biomedicals | 2194542 | |
| Biolistic Delivery System | BioRad | 165-2257 | |
| Gold particles (Au Powder) | Ferro Electronic Material Systems | 6420 2504, JZP01010KM | |
| or | |||
| Gold Particles 1.0 μm | BioRad | 165-2263 |
References
- Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, 231-237 (2003).
- Nass, R., Blakely, R. D. The Caenorhabditis elegans dopaminergic system: opportunities for insights into dopamine transport and neurodegeneration. Annual review of pharmacology and toxicology. 43, 521-544 (2003).
- Lapierre, L. R., Hansen, M. Lessons from C elegans signaling pathways for longevity. Trends in endocrinology and metabolism TEM. 23, 637-644 (2012).
- Kenyon, C. The plasticity of aging insights from long-lived mutants. Cell. 120, 449-460 (2005).
- Vanfleteren, J. R., Braeckman, B. P. Mechanisms of life span determination in Caenorhabditis elegans. Neurobiology of aging. 20, 487-502 (1999).
- Poole, R. J., Bashllari, E., Cochella, L., Flowers, E. B., Hobert, O. A Genome-Wide RNAi Screen for Factors Involved in Neuronal Specification in Caenorhabditis elegans. PLoS genetics. 7, e1002109 (2011).
- Stiernagle, T. Maintenance of C elegans WormBook the online review of C. elegans biology. , 1-11 (2006).
- Win, M. T., et al. Validated Liquid Culture Monitoring System for Lifespan Extension of Caenorhabditis elegans through Genetic and Dietary Manipulations. Aging and disease. 4, 178-185 (2013).
- Clegg, E. D., LaPenotiere, H. F., French, D. Y., Szilagyi, M. Use of CeHR Axenic Medium for Exposure and Gene Expression Studies. East Coast Worm Meeting. , (2002).
- Severance, S., et al. Genome-wide analysis reveals novel genes essential for heme homeostasis in Caenorhabditis elegans. PLoS genetics. 6, e1001044 (2010).
- Rajagopal, A., et al. Haem homeostasis is regulated by the conserved and concerted functions of HRG-1 proteins. Nature. 453, 1127-1131 (2008).
- Nass, R., Hamza, I. Chapter 1 Unit 1 9. The nematode C. elegans as an animal model to explore toxicology in vivo: solid and axenic growth culture conditions and compound exposure parameters. Current protocols in toxicology editorial board, Mahin D. Maines. , (2007).
- Schweinsberg, P. J., Grant, B. D. C. elegans gene transformation by microparticle bombardment WormBook the online review of C. elegans biology. , 1-10 (2013).
- Rao, A. U., Carta, L. K., Lesuisse, E., Hamza, I. Lack of heme synthesis in a free-living eukaryote. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 4270-4275 (2005).
- Szewczyk, N. J., Kozak, E., Conley, C. A. Chemically defined medium and Caenorhabditis elegans. BMC biotechnology. 3, 19 (2003).
- Szewczyk, N. J., et al. Delayed development and lifespan extension as features of metabolic lifestyle alteration in C elegans under dietary restriction. The Journal of experimental biology. 209, 4129-4139 (2006).
- White, C., et al. HRG1 is essential for heme transport from the phagolysosome of macrophages during erythrophagocytosis. Cell metabolism. 17, 261-270 (2013).
- Chen, C., Samuel, T. K., Sinclair, J., Dailey, H. A., Hamza, I. An intercellular heme-trafficking protein delivers maternal heme to the embryo during development in C elegans. Cell. 145, 720-731 (2011).
- Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetics. 157, 1217-1226 (2001).
- Berezikov, E., Bargmann, C. I., Plasterk, R. H. Homologous gene targeting in Caenorhabditis elegans by biolistic transformation. Nucleic acids research. 32, e40 (2004).
- Semple, J. I., Biondini, L., Lehner, B. Generating transgenic nematodes by bombardment and antibiotic selection. Nature Methods. 9, 118-119 (2012).
