نقدم بيوشيب القائم ميكروفلويديك الكهروكيميائية للكشف عن تهجين الحمض النووي. التالية ssDNA التحقيق functionalization، يتم دراسة خصوصية وحساسية، والحد من الكشف مع أهداف ssDNA تكميلية وغير تكميلية. وتوضح النتائج أن تأثير الأحداث تهجين الحمض النووي على النظام الكهروكيميائية، مع حد الكشف عن 3.8 نانومتر.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
وبيوشيب الكهروكيميائية استنادا ميكروفلويديك لتسمية خالية تحليل الحمض النووي التهجين
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
التصغير من الإجراءات التحليلية في الفوق الصغيرة الحجم يوفر مزايا هامة في ما يخص وقت رد الفعل، والتكلفة، والتكامل من الخطوات السابقة للتجهيز. استخدام هذه الأجهزة نحو تحليل الأحداث تهجين الحمض النووي هو مهم لأنه يقدم تكنولوجيا لتقييم الوقت الحقيقي من المؤشرات الحيوية في نقطة من الرعاية لمختلف الأمراض. ومع ذلك، عندما يقلل من البصمة جهاز هيمنة مختلف الظواهر الفيزيائية الزيادات. هذه الظواهر تؤثر على دقة تصنيع وموثوقية تشغيل الجهاز. ولذلك، هناك حاجة كبيرة لافتعال بدقة وتعمل هذه الأجهزة بطريقة استنساخه من أجل تحسين الأداء العام. هنا، نحن تصف البروتوكولات والأساليب المستخدمة لتصنيع وتشغيل بيوشيب الكهروكيميائية استنادا ميكروفلويديك لتحليل دقيق للأحداث تهجين الحمض النووي. يتكون بيوشيب من جزأين: شريحة ميكروفلويديك معثلاث قنوات صغيرة موازية مصنوعة من (PDMS) polydimethylsiloxane، و 3 × 3 العريض الكهروكيميائية الدقيقة رقاقة. تم الكشف عن الأحداث تهجين الحمض النووي باستخدام مقاومة الكهروكيميائية الطيفي (EIS) التحليل. تحليل EIS يتيح مراقبة التغيرات في خصائص النظام الكهروكيميائية التي هي المهيمنة في هذه المقاييس طول. مع القدرة على رصد التغيرات في كل من تهمة نقل والمقاومة الأنتشارى مع جهاز الاستشعار البيولوجي، ونحن لشرح الانتقائية لأهداف ssDNA التكميلية، حد كشف حساب من 3.8 نانومتر، و 13٪ عبر التفاعل مع غيرها من ssDNA غير التكميلية التالية 20 دقيقة من الحضانة. هذه المنهجية يمكن تحسين أداء الأجهزة المنمنمة التي كتبها توضيح على سلوك نشر في النظام الصغيرة الحجم وذلك من خلال تمكين دراسة الأحداث تهجين الحمض النووي.
المقدمة
المختبر على واحد في رقاقة ميكروفلويديك الأجهزة (LOC) توفر مزايا عديدة في التشخيص السريري، والرصد البيئي والبحوث الطبية الحيوية. هذه الأجهزة تستخدم قنوات ميكروفلويديك للسيطرة على تدفق السوائل لمناطق رقاقة حيث مجموعة متنوعة من الإجراءات يمكن أن تأخذ مكان بما في ذلك خلط الكاشف، استنادا تقارب ملزمة، نقل الإشارة، وزراعة الخلايا 1-4. ويوفر مزايا عديدة أكثر على microfluidics أدوات التشخيص السريرية التقليدية مثل القراء لوحة microwell أو الكهربي المقايسات تحول جل. تتطلب أجهزة ميكروفلويديك 2 إلى 3 أوامر من حجم (nanoliters بدلا من ميكرولتر) أقل الكواشف لإجراء فحوصات مماثلة. أيضا، يمكن لهذه الأجهزة أن تزيد من السرعة التي تحدث بع....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. التصنيع الدقيق للرقاقة ميكروفلويديك
- إعداد الكهروكيميائية رقاقة
- نمط الذهب أقطاب
- شطف فارغة 4 '' رقاقة السيليكون (درجة الجودة الأولية) مع الأسيتون، والميثانول، والأيزوبروبانول ("AMI" نظيفة). شطف الأيزوبروبانول من الرقاقة مع الماء منزوع الأيونات (DI)، يليه التجفيف مع N 2 بندقية.
- تنمو 1 ميكرون سميك....
- نمط الذهب أقطاب
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
عملية التصنيع السيطرة عليها ودقيقة للجهاز التجريبي ضروري في مجال البحوث. فإنه يسمح للباحثين بالحصول على التجارب التي مرت استنساخه والعالية. هنا نكون قد أظهرت عالية الغلة، وعملية التصنيع الدقيق استنساخ عالية من بيوشيب الكهروكيميائية استنادا ميكروفلويديك (الشكل 1). مع انخفاض معدل الفشل، وقد أظهرت بعض الأجهزة القضايا الربط التي تؤدي إلى تسرب الحل. من أجل التحقق من صحة النشاط الكهروكيميائية من بيوشيب، تتم القياسات voltammetry دوري في شغل و microchannels مع الكهربائية .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تثبت إجراءاتنا تصنيع وبيوشيب الكهروكيميائية القائم ميكروفلويديك واستخدامه لتحليل الأحداث تهجين الحمض النووي. من خلال عملية التصنيع الدقيق عالية الغلة تسيطر علينا تطوير جهاز تتألف من قنوات الميكروسكيل متكاملة مع مجموعة واسعة من محولات الطاقة الكهروكيميائية. لقد وضعت معايير للرقابة لمعالجة الإجراء ضوئيه من الشريحة الكهروكيميائية والعفن قناة ميكروفلويديك من خلال نهج تكرارية. توفر هذه الخطوات مبادئ توجيهية لخلق المستقبل من غيرها من الأجهزة التحليلية المنمنمة. الأهم من ذلك، أنها توفر و.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
شكر وتقدير
المؤلفون تقر مؤسسة روبرت دبليو الألمانية، ووكالة الدفاع لتقليص التهديد (DTRA)، ومؤسسة العلوم الوطنية الناشئة حدود في البحث والابتكار (EFRI) للحصول على الدعم المالي. شكرا الكتاب أيضا ماريلاند Nanocenter وFablab من أجل دعم مرفق غرف الأبحاث.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| رقاقة السيليكون 4 '' | Ultrasil | 4-5664 | جانب واحد مصقول ؛ نوع P. مخدر البورون. التوجيه 1-0-0 ؛ سمك 500 ميكرون ؛ المقاومة 10-20 أوم & middot; سم |
| شيبلي 1813 مقاوم للضوء ("PR1") مقاوم | للضوء الإيجابي | Microchem | |
| AZ5214 مقاوم للضوء ("PR2") | Hoechst Celanse | مقاوم للضوء الإيجابي | |
| SU-8 50 مقاوم للضوء ("PR3") مقاوم | للضوء | السلبي Microchem | |
| الذهب Transene | TFA | لا | |
| حفر الكروم | Transene | 1020AC | بدون تخفيف |
| PDMS المطاط | Dow Corning | 3097366 1004 | |
| عامل علاج PDMS | Dow Corning | 3097358 1004 | |
| أداة تثقيب الخزعة | Healthlink | BP20 | |
| Tygon أنابيب مرنة | Cole Parmer & nbsp ؛ | R 3603 | 0.015 " |
| Tygon محول مرن | Cole Parmer & nbsp ؛ | 06417-41 | 0.0625 " |
| 1 مل حقنة | بيكتون ديكنسون | 301025 | |
| فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة | فلوكا | 1551139 | |
| فوسفات البوتاسيوم ثنائي القاعدة اللامائي | سيجما | RES20765-A7 | |
| كلوريد الصوديوم | سيجما ألدريتش | S7653 | |
| تريس (2-كربوكسي إيثيل) فوسفين | ألدريتش | C4706 | |
| 6-mercapto-1-hexanol | Aldrich | 451088 | |
| 20x مركز سيترات الصوديوم المحلول الزجاجي | Sigma | 93017 | |
| سداسي سيانوفيرات البوتاسيوم (III) | Aldrich | 455946 | |
| SSDNA التكميلية # 1 | تقنيات الحمض النووي المتكاملة (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5'-GGGACGTCCACGGAGCGCTA TCGGAGCTTT-3 ' |
| الهدف ssDNA # 2 | تقنيات الحمض النووي المتكاملة (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5'- / 5ThioMC6-D / ACGCGTCAGGTCATTGACGA ATCGATGAGT-3 ' |
| ssDNA التكميلية # 2 | تقنيات الحمض النووي المتكاملة (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5'-ACTCATCGATTCGTCAATGA CCTGACCCGT-3 ' |
| الهدف ssDNA # 3 | تقنيات الحمض النووي المتكاملة (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5'- / 5ThioMC6-D / ACCTAGATCCAGTAGTTAGA CCCATGATGA-3' |
| ssDNA التكميلية # 3 | تقنيات الحمض النووي المتكاملة (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5'-TCATCATGGGTCTAACT GGATCTAGGT-3' |
| <قوي>أداة < / قوي > | |||
| ترسيب بخار كيميائي معزز بالبلازما (PECVD) نظام | Oxford Instruments | PlasmaLab 100 | ضغط الغرفة 1,000 mTorr ، درجة الحرارة 200 & # 176 ؛ C ، طاقة التردد اللاسلكي 20 واط ، الغازات: أ) N2< / sub>O معدل التدفق 710 sccm ؛ ب) تكوين 5٪ SiH 4 < / sub > و 95٪ N2< / sub> معدل تدفق الغازات 170 sccm ، SiO2< / sub> معدل النمو 690 & # 197 ؛ / دقيقة. |
| وحدة الاخرق DC | AJA International | ATC 1800-V | للكروم: ضغط الغرفة 10 mTorr ، معدل تدفق الأرجون 20 سم سم ، طاقة التيار المستمر الموردة 200 واط ، معدل الرش 10 نانومتر / دقيقة. للذهب: ضغط الغرفة 10 mTorr ، معدل تدفق الأرجون 20 sccm ، طاقة التيار المستمر الموردة 200 واط ، معدل الرش 36 نانومتر / دقيقة. |
| نظام تبخر الشعاع | الإلكتروني Denton | مصمم خصيصا | للتيتانيوم: ضغط الغرفة < 2 × 10-6< / sup> Torr ، تم تزويد الطاقة للمدفع الإلكتروني 7.5 كيلو واط ، تيار خيوط 150-200 مللي أمبير ، معدل التبخر 6-10 &# 197 ؛ / ثانية. للبلاتين: ضغط الغرفة < ؛ 2 × 10 < سوب >-6 < / سوب> Torr ، الطاقة الموردة للمدفع الإلكتروني 7.5 كيلو واط ، تيار الشعيرة 150-200 مللي أمبير ، معدل التبخر 2-3 &# 197 ؛ / ثانية. |
| Potentiostat | CH Instruments | 660D | |
| KD Scientific | KDS230 |
المراجع
- Hong, J., Edel, J. B., deMello, A. J. Micro- and nanofluidic systems for high-throughput biological screening. Drug Discov. Today. 14, 134-146 (2009).
- Sun, Y., Kwok, Y. C. Polymeric microfluidic system for DNA analysis. Anal. Chim. Acta. 556, 80-96 (2006).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
