Nous présentons une biopuce microfluidique à base électrochimique-pour la détection d'hybridation d'ADN. Après ssADN sonde fonctionnalisation, la spécificité, la sensibilité et la limite de détection sont étudiées avec des objectifs de ssADN complémentaires et non complémentaires. Les résultats illustrent l'influence des événements d'hybridation d'ADN sur le système électrochimique, avec une limite de détection de 3,8 nM.
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Article de méthode
Une biopuce microfluidique électrochimique à base d'analyse ADN hybridation Sans étiquette
Dans cet article
Résumé
Résumé
La miniaturisation des procédures analytiques de paillasse dans la micro-échelle fournit des avantages significatifs en ce qui concerne le temps de réaction, le coût, et l'intégration des étapes de pré-traitement. L'utilisation de ces dispositifs vers l'analyse des événements d'hybridation de l'ADN est important car il offre une technologie pour de vrai l'évaluation des temps de biomarqueurs au point-of-care pour diverses maladies. Toutefois, lorsque l'empreinte de l'appareil diminue la domination de divers phénomènes physiques augmente. Ces phénomènes influent sur la précision de fabrication et la fiabilité de fonctionnement du dispositif. Par conséquent, il existe un grand besoin pour la fabrication de précision et de faire fonctionner ces dispositifs d'une manière reproductible dans le but d'améliorer la performance globale. Ici, nous décrivons les protocoles et les méthodes utilisées pour la fabrication et le fonctionnement d'une biopuce microfluidique à base électrochimique pour une analyse précise des événements d'hybridation d'ADN. La biopuce est composé de deux parties: une puce microfluidique avectrois micro-canaux parallèles en polydiméthylsiloxane (PDMS), et une micro-puce Arrayed électrochimique 3 x 3. Les événements d'hybridation d'ADN sont détectés en utilisant la spectroscopie d'impédance électrochimique (SIE) d'analyse. L'analyse permet EIS variations de surveillance des propriétés du système électrochimique qui sont dominantes à ces échelles de longueur. Avec la possibilité de surveiller les changements à la fois de transfert de charge et de résistance à la diffusion avec le biocapteur, nous démontrons que la sélectivité pour les objectifs de ADNsb complémentaires, une limite de détection calculée de 3,8 nM, et une réactivité croisée avec d'autres ADN à un brin non-complémentaire de 13% après 20 min d'incubation. Cette méthode permet d'améliorer les performances des dispositifs miniaturisés en éclaircissant sur le comportement de diffusion à l'échelle micro-régime et en permettant l'étude des événements d'hybridation d'ADN.
Introduction
Lab-on-a-chip microfluidique dispositifs (LOC) de fournir de nombreux avantages dans le diagnostic clinique, la surveillance environnementale et la recherche biomédicale. Ces dispositifs utilisent des canaux microfluidiques pour commander l'écoulement de fluide dans les régions de la puce où une variété de procédures peut avoir lieu notamment de mélange des réactifs, l'affinité de liaison sur la base, la transduction du signal, et la culture de cellules 4.1. Microfluidique offre de nombreux avantages par rapport aux outils de diagnostic cliniques conventionnels tels que des lecteurs de plaques de microtitration ou des essais de retard sur gel d'....
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Protocole
1. microfabrication de la puce microfluidique
- Préparer électrochimique Chip
- Motif d'or électrodes
- Rincez un vide '' tranche 4 de silicium (prime de qualité de qualité) avec de l'acétone, le méthanol et l'isopropanol («AMI» propre). Rincer le isopropanol de la tranche avec de l'eau déminéralisée (DI) suivie d'un séchage avec N 2 armes à feu.
- Croître une couche de passivation d'épaisseur 1 pm de SiO 2 avec un dépôt chimique en phase vapeur assisté par plasma (PECVD) outil. Déposer une couche épaisse de 200 Å de chrome suivie d'une épaisse couche de 2000 Å d'or avec un o....
- Motif d'or électrodes
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Résultats
Procédé de fabrication précise et contrôlable pour le dispositif expérimental est essentiel dans la recherche. Il permet aux chercheurs d'obtenir des expériences de débit reproductibles et élevés. Ici, nous avons démontré un rendement élevé, un processus de microfabrication haute reproductibilité d'une biopuce microfluidique à base électrochimique (Figure 1). Avec un faible taux d'échec, quelques dispositifs ont montré des problèmes de liaison qui mènent à une fuite de solution. Afin de valider l'activi.......
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Discussion
Nos travaux montrent la fabrication d'une biopuce à base électrochimique microfluidique, et son utilisation pour l'analyse d'événements d'hybridation d'ADN. Grâce à un processus de microfabrication à haut rendement contrôlée, nous développons un dispositif composé de canaux micrométriques intégrés à un réseau de transducteurs électrochimiques. Nous avons mis au point des paramètres de traitement de la procédure de contrôle de photolithographie de la puce électrochimique et le moule à travers un canal.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à divulguer.
Remerciements
Les auteurs remercient la Fondation Robert W. Deutsch, l'Agence de réduction de la Defense Threat (DTRA), et la Fondation nationale des sciences émergentes frontières dans la recherche et l'innovation (EFRI) pour un soutien financier. Les auteurs remercient également le NanoCenter Maryland et son Fablab de soutien de salle blanche.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Plaquette de silicium 4'' | Ultrasil | 4-5664 | Poli sur une face ; de type P ; Dopé au bore ; Orientation 1-0-0 ; Epaisseur 500 microns ; Résistance 10-20 ohm· ; cm |
| Shipley 1813 photorésine (« PR1 ») | Microchem | photoresist | |
| AZ5214 photoresist (« PR2 ») | Hoechst Celanse | photoresist | |
| SU-8 50 photoresist (« PR3 ») | Microchem | negative photoresist | |
| etc | Transene | TFA | No dilution |
| Chromium etc | Transène | 1020AC | |
| Élastomère PDMS | Dow Corning | 3097366 1004 | |
| PDMS Agent de durcissement | Dow Corning | 3097358 1004 | |
| Outil de poinçonnage de biopsie | Healthlink | BP20 | |
| Tygon Tube flexible | Cole Parmer ; | R 3603 | 0.015" |
| Tygon adaptateur flexible | Cole Parmer ; | 06417-41 | 1 ml 0,0625 |
| Beckton-Dickenson | 301025 | ||
| Phosphate de potassium monobasique | Fluka | 1551139 | |
| Phosphate de potassium dibasique anhydre | Sigma | RES20765-A7 | |
| Chlorure de sodium | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| tris(2-carboxyéthyl)phosphine | Aldrich | C4706 | |
| 6-mercapto-1-hexanol | Aldrich | 451088 | |
| 20x tampon concentré salin-citrate de sodium | Sigma | 93017 | |
| Hexacyanoferrate de potassium(III) | Aldrich | 455946 | |
| Complémentaire ssDNA #1 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5'-GGGACGTCCACGGAGCGCTA TCGGAGCTTT-3' |
| Cible ssDNA #2 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5'-/5ThioMC6-D/ACGCGTCAGGTCATTGACGA ATCGATGAGT-3' |
| Complémentaire ssDNA #2 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5'-ACTCATCGATTCGTCAATGA CCTGACCCGT-3' |
| Cible ssDNA #3 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5'-/5ThioMC6-D/ACCTAGATCCAGTAGTTAGA CCCATGATGA-3' |
| Complémentaire ssDNA #3 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5'-TCATCATGGGTCTAACTACT GGATCTAGGT-3' |
| Instrument | |||
| Plasma Enhanced Vapor Deposition (PECVD) | Oxford Instruments | PlasmaLab System 100 | Pression de la chambre 1 000 mTorr, Tempreture 200 ° ; C, puissance RF 20 W, Gaz : a) N2O débit 710 sccm ; b) une composition de 5 % de gaz SiH4 et de 95 % de gaz N2 débit 170 sccm, SiO2 taux de croissance 690 Å ;/min. |
| Unité de pulvérisation CD | AGA INTERNATIONAL | ATC 1800-V | Pour Chrome : Pression de la chambre 10 mTorr, Débit d’argon 20 sccm, Puissance CC fournie 200 W, Débit de pulvérisation 10 nm/min. Pour l’or : Pression de la chambre 10 mTorr, débit d’argon 20 sccm, Puissance DC fournie 200 W, Taux de pulvérisation 36 nm/min. |
| Système d’évaporation par faisceau d’électrons | Denton | Fabriqué sur mesure | Pour le titane : Pression de la chambre < 2 x 10-6 Torr, Puissance fournie à l’e-gun 7,5 kW, Courant de filament 150-200 mA, Taux d’évaporation 6-10 Å ;/sec. Pour le platine : Pression de la chambre < 2 x 10-6 Torr, Puissance fournie à l’e-gun 7,5 kW, Courant de filament 150-200 mA, Taux d’évaporation 2-3 Å ;/sec. |
| Potentiostat | CH Instruments | 660D | |
| Pousse-seringue | KD Scientific | KDS230 |
Références
- Hong, J., Edel, J. B., deMello, A. J. Micro- and nanofluidic systems for high-throughput biological screening. Drug Discov. Today. 14, 134-146 (2009).
- Sun, Y., Kwok, Y. C. Polymeric microfluidic system for DNA analysis. Anal. Chim. Acta. 556, 80-96 (2006).
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