Se presenta un biochip electroquímico basado en microfluídico para la detección de la hibridación de ADN. Tras ssDNA sonda funcionalización, la especificidad, sensibilidad y límite de detección se estudian con objetivos ssDNA complementarias y no complementarias. Resultados ilustran la influencia de los eventos de hibridación de ADN en el sistema electroquímico, con un límite de detección de 3,8 nM.
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Artículo de método
Un biochip electroquímico basado en microfluidos para el análisis de hibridación ADN-Label libre
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Resumen
Resumen
La miniaturización de los procedimientos analíticos de sobremesa en la escala micro proporciona ventajas significativas en cuanto a tiempo de reacción, el coste, y la integración de las etapas de pre-procesamiento. La utilización de estos dispositivos hacia el análisis de los eventos de hibridación de ADN es importante porque ofrece una tecnología para la evaluación en tiempo real de los biomarcadores en el punto de atención para diversas enfermedades. Sin embargo, cuando la huella dispositivo disminuye el dominio de diversas ampliaciones de los fenómenos físicos. Estos fenómenos influyen en la precisión de fabricación y fiabilidad de funcionamiento del dispositivo. Por lo tanto, hay una gran necesidad de fabricar con precisión y operar estos dispositivos en una manera reproducible con el fin de mejorar el rendimiento global. A continuación, describimos los protocolos y los métodos utilizados para la fabricación y el funcionamiento de un biochip electroquímico basado en microfluidos para el análisis preciso de los eventos de hibridación de ADN. El biochip se compone de dos partes: un chip de microfluidos contres micro-canales paralelos hechos de polidimetilsiloxano (PDMS), y un Arrayed electroquímica micro-chip de 3 x 3. Los eventos de hibridación de ADN se detectan usando un análisis de espectroscopia de impedancia electroquímica (EIS). El análisis EIS permite monitoreo de las variaciones de las propiedades del sistema electroquímico que son dominantes en estas escalas de longitud. Con la capacidad para monitorizar los cambios tanto de transferencia de carga y la resistencia difusional con el biosensor, se demuestra la selectividad a los objetivos de ADNss complementarios, un límite de detección calculado de 3,8 nM, y una reactividad cruzada del 13% con otros ssDNA no complementaria siguiente 20 min de incubación. Esta metodología puede mejorar el rendimiento de dispositivos miniaturizados por elucidar sobre el comportamiento de la difusión en el régimen de micro-escala y al permitir el estudio de los acontecimientos de hibridación de ADN.
Introducción
Lab-on-a-chip de microfluidos dispositivos (LOC) proporciona numerosas ventajas en el diagnóstico clínico, monitoreo ambiental y la investigación biomédica. Estos dispositivos utilizan canales de microfluidos para controlar el flujo de fluido a las regiones del chip donde una variedad de procedimientos puede tener lugar incluida la mezcla de reactivo, de afinidad basada en la unión, transducción de señales, y la célula de cultivo de 1-4. Microfluídica proporciona muchas ventajas sobre las herramientas de diagnóstico clínicos convencionales, tales como lectores de placas de micropocillos o ensayos de cambio de gel electroforético. Los dispositivos microfluí....
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Protocolo
1. microfabricación del chip de microfluidos
- Preparar Electroquímica Viruta
- Patrón Oro Electrodos
- Enjuague un espacio en blanco 4 '' oblea de silicio (calidad de primer grado) con acetona, metanol, e isopropanol ("AMI" limpio). Enjuague el isopropanol de la oblea con agua desionizada (DI) seguido de secado con pistola de N 2.
- Crecer una gruesa capa de pasivación 1 m SiO2 con la deposición de vapor químico mejorada por plasma herramienta (PECVD). Depositar una capa de espesor de 200 Å de cromo seguido de una capa de espesor de 2.000 Å de oro con una herramienta de pulverización catódica DC.
- ....
- Patrón Oro Electrodos
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Resultados
Un proceso de fabricación controlable y precisa para el dispositivo experimental es esencial en la investigación. Se permite a los investigadores obtener rendimiento experimentos reproducibles y altas. Aquí hemos demostrado un alto rendimiento, el proceso de microfabricación alta reproducibilidad de un biochip electroquímico basado en microfluídico (Figura 1). Con una baja tasa de fracaso, pocos dispositivos han mostrado problemas de unión que llevan a la solución de las fugas. Con el fin de validar la .......
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Discusión
Nuestros procedimientos demuestran la fabricación de un biochip electroquímico basado en microfluidos y su utilización para el análisis de los eventos de hibridación de ADN. A través de un proceso de microfabricación de alto rendimiento controlada desarrollamos un dispositivo compuesto por canales microescala integrados con una serie de transductores electroquímicos. Hemos ideado parámetros de procesamiento controlados para el procedimiento de fotolitografía del chip electroquímica y el molde a través de un canal de mic.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores agradecen la Fundación Robert W. Deutsch, la Agencia de Reducción de Amenazas de Defensa (DTRA), y la Fundación Nacional de Ciencias Emergentes Fronteras en la Investigación y la Innovación (EFRI) para el apoyo financiero. Los autores también agradecen a la Maryland NanoCenter y su FabLab apoyo instalación de salas limpias.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Oblea de silicona de 4'' | Ultrasil | 4-5664 | Pulido por un lado; Tipo P; Boro dopado; Orientación 1-0-0; Espesor 500 micras; Resistencia 10-20 ohm· cm |
| Shipley 1813 fotorresistente ("PR1") | Microchem | fotorresistente | |
| AZ5214 fotorresistente ("PR2") | Hoechst Celanse | fotorresistente | |
| positivo SU-8 50 fotorresistente ("PR3") | Microchem | fotorresistente negativo | |
| Grabador de oro | Transene | TFA | Sin dilución |
| Grabador de cromo | Transene | 1020AC | Sin dilución |
| Elastómero PDMS | Dow Corning | 3097366 1004 | |
| PDMS Agente de curado | Dow Corning | 3097358 1004 | |
| Herramienta de punzonado para biopsia | Healthlink | BP20 | |
| Tygon tubo flexible | Cole Parmer | R 3603 | 0.015" |
| Tygon adaptador flexible | Cole Parmer | 06417-41 | Jeringa de 0.0625" |
| 1 ml | Beckton-Dickenson | 301025 | |
| Fosfato de potasio monobásico | Fluka | 1551139 | |
| Fosfato de potasio dibásico anhidro | Sigma | RES20765-A7 | |
| Cloruro de sodio | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| tris(2-carboxietil)fosfina | Aldrich | C4706 | |
| 6-mercapto-1-hexanol | Aldrich | 451088 | |
| 20x tampón concentrado de citrato de sodio y solución salina | Sigma | 93017 | |
| Hexacianoferrato de potasio(III) | Aldrich | 455946 | |
| ssDNA complementario #1 | Tecnologías de ADN integradas (IDT) | 100 nmol ADN oligo | 5'-GGGACGTCCACGGAGCGCTA TCGGAGCTTT-3' |
| Objetivo ssDNA #2 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmol ADN oligo | 5'-/5ThioMC6-D/ACGCGTCAGGTCATTGACGA ATCGATGAGT-3' |
| Complementario ssDNA #2 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmol ADN oligo | 5'-ACTCATCGATTCGTCAATGA CCTGACCCGT-3' |
| Objetivo ssDNA #3 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmol ADN oligo | 5'-/5ThioMC6-D/ACCTAGATCCAGTAGTTAGA CCCATGATGA-3' |
| Complementario ssDNA #3 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmol ADN oligo | 5'-TCATCATGGGTCTAACTACT GGATCTAGGT-3' |
| Instrument | |||
| Plasma Enhanced Vapor Deposition (PECVD) | Oxford Instruments | PlasmaLab System 100 | Presión de cámara 1.000 mTorr, Tempreture 200 ° C, potencia de RF 20 W, gases: a) Caudal N2O 710 sccm; b) una composición de 5% de SiH4 y 95% de N2 caudal de gases 170 sccm, SiO2 tasa de crecimiento 690 Å/min. |
| Unidad de pulverización catódica de CC | AJA INTERNATIONAL | ATC 1800-V | para cromo: Presión de la cámara 10 mTorr, Caudal de argón 20 sccm, Potencia de CC suministrada 200 W, Tasa de pulverización catódica 10 nm/min. Para oro: Presión de la cámara 10 mTorr, Caudal de argón 20 sccm, Potencia de CC suministrada 200 W, Tasa de pulverización catódica 36 nm/min. |
| Sistema de evaporación E-beam | Denton Hecho | a medida | para titanio: Presión de la cámara < 2 x 10-6 Torr, Potencia suministrada a la pistola electrónica 7,5 kW, Corriente de filamento 150-200 mA, Tasa de evaporación 6-10 Å/seg. Para Platino: Presión de la cámara < 2 x 10-6 Torr, Potencia suministrada a la pistola electrónica 7,5 kW, Corriente de filamento 150-200 mA, Tasa de evaporación 2-3 Å/seg. |
| Potenciostato | CH Instruments | 660D | |
| Bomba de jeringa | KD Scientific | KDS230 |
Referencias
- Hong, J., Edel, J. B., deMello, A. J. Micro- and nanofluidic systems for high-throughput biological screening. Drug Discov. Today. 14, 134-146 (2009).
- Sun, Y., Kwok, Y. C. Polymeric microfluidic system for DNA analysis. Anal. Chim. Acta. 556, 80-96 (2006).
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