Murine लिम्फ नोड stromal कोशिकाओं का अलगाव
Summary
Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.
Abstract
Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host.
Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.
Introduction
लिम्फ नोड्स विदेशी और आत्म एंटीजन के खिलाफ अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया शुरू की और समन्वय कर रहे हैं, जहां विशेष डिब्बों हैं. यहाँ प्रस्तुत प्रक्रिया लिम्फ नोड एकल कक्ष निलंबन प्राप्त करने और कई अणुओं की सतह अभिव्यक्ति का कहना है कि व्यवहार्य लिम्फ नोड stromal कोशिकाओं के लिए पहुँच प्राप्त करने के लिए स्वचालित यांत्रिक pipetting के साथ संयुक्त एक छोटी enzymatic पाचन वर्णन करता है.
लिम्फ नोड stromal सेल के तीन प्रमुख कार्यों लिम्फ नोड के पाड़ फार्म और पूरा: पहले वे शरीर के तरल पदार्थ एंटीजन, रोगजनकों और उनके रोगज़नक़ जुड़े आणविक पैटर्न (PAMPs), साथ ही साइटोकिन्स और खतरे जुड़े आणविक पैटर्न नमूने को फिल्टर (damps) वर्तमान शरीर में. दूसरा, वे बातचीत और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया आरंभ करने के लिए प्रतिजन पेश कोशिकाओं (एपीसी) और लिम्फोसाइटों को आकर्षित करने और हिदायत; और तीसरा, वे लिम्फोसाइटों 1 की homeostasis और भेदभाव के लिए एक संरचनात्मक वातावरण प्रदान-3. सूजन लिम्फ नोड stromal कोशिकाओं वृद्धि कारकों, साइटोकिन्स और chemokines उत्पादन के दौरान, वृक्ष के समान कोशिकाओं (DCs) के बीच बातचीत का आयोजन जिससे, टी, और बी कोशिकाओं में सूजन के लिए अनुकूल है. प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के आर्केस्ट्रा के कारण अलग stromal सेल आबादी द्वारा गठित जटिल संरचनात्मक वास्तुकला के लिए ही संभव है.
लिम्फ नोड stromal कोशिकाओं CD45 नकारात्मक कोशिकाओं रहे हैं और तंतुप्रसू और endothelial कोशिकाओं 1 -6 में CD31 की अभिव्यक्ति या gp38 द्वारा प्रतिष्ठित किया जा सकता. CD31 + रक्त endothelial कोशिकाओं को परिभाषित करता है (सी) – gp38 + CD31 + लसीका endothelial कोशिकाओं (LEC), gp38 परिभाषित करता है: – Gp38 + CD31 (तंतुप्रसू जालीदार कोशिकाओं को भी एफआरसी के रूप में जाना टीआरसी) टी क्षेत्र जालीदार कोशिकाओं को परिभाषित करता है. इसके अलावा, subpopulations के लक्षण वर्णन अन्य लिम्फ नोड stromal कोशिकाओं के अस्तित्व का पता चला. दरअसल, एक छोटे pericyte की तरह सेल की आबादी के भीतर विशेषता थीgp38 – CD31 – जनसंख्या 7. इसलिए, अलगाव की प्रक्रिया का अनुकूलन अलग लिम्फ नोड stromal कोशिकाओं के कार्यात्मक संपत्तियों की पहचान और लक्षण वर्णन के लिए फायदेमंद है.
लिम्फ नोड stromal कोशिकाओं पाचन के विकास से पहले लिम्फ नोड stromal कोशिकाओं का अध्ययन ऊतक अनुभाग और माइक्रोस्कोपी का उपयोग सीटू टिप्पणियों में सीमित था प्रोटोकॉल. फिर भी, संरचनात्मक और कार्यात्मक अध्ययन लिम्फ नोड stromal कोशिकाओं की महत्वपूर्ण विशेषताओं दिखाया. लिम्फ नोड stromal कोशिकाओं उच्च endothelial को लिम्फ नोड के subcapsular साइनस से लसीका और जुड़े कम आणविक जन प्रोटीन transports जो नाली प्रणाली नामक एक जटिल 3 आयामी संरचना, के लिए फार्म podoplanin, कोलेजन और बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) प्रोटीन के साथ जुड़े रहे हैं टी कोशिकाओं जोन 8 में venules. DCs स्ट्रोमा कोशिकाओं के साथ निकट संपर्क में हैं और ट्यूबलर चुनाव में फैला हुआ देखा जा सकता हैDuit संरचना तरल पदार्थ का नमूना और एंटीजन 8 पता लगाने के लिए. DCs साथ लिम्फ नोड stromal कोशिकाओं (TRCs और LECs) की बातचीत chemokines CCL21 और CCL19 9,10 की रिहाई और प्रस्तुति द्वारा मध्यस्थता है. CCL19 और CCL21 लिम्फ नोड टी सेल क्षेत्र 4,11 को विस्थापित करने DCs और टी कोशिकाओं की सुविधा CCR7 रिसेप्टर द्वारा मान्यता प्राप्त हैं. इसी तरह chemokines का उपयोग कर के बावजूद, DCS और टी कोशिकाओं लिम्फ नोड्स 12 में विभिन्न प्रवास मार्गों है. बाद में, लिम्फ नोड और शुद्ध लिम्फ नोड stromal कोशिकाओं के अलगाव के enzymatic पाचन का उपयोग, कार्यात्मक पढ़ाई अलग लिम्फ नोड stromal कोशिकाओं की भूमिका और DCS और टी / बी कोशिकाओं 6,13 के साथ बातचीत करने की क्षमता पर प्रदर्शन किया गया. सबसे पहले, IFN-γ उत्पादन प्रेरक टी कोशिकाओं और लिम्फ नोड stromal कोशिकाओं के बीच crosstalk माध्यमिक lymphoid अंगों 14-16 में टी सेल प्रतिक्रिया और प्रसार गीला हो जाना दिखाया metabolite नाइट्रिक ऑक्साइड के उत्पादन को प्रेरित करता है. दूसरा, लसीका nस्तोत्र stromal कोशिकाओं आईएल 10 से 17 के उत्पादन के माध्यम से नियामक डीसी सबसेट के भेदभाव का समर्थन करने के लिए, और आईएल -7 6,18 के उत्पादन के माध्यम से भोले टी सेल homeostasis मिलाना सूचित किया गया है. तीसरा, लिम्फ नोड stromal कोशिकाओं में TLR अभिव्यक्ति stromal कोशिकाओं ऊतक चोट के दौरान जारी एक संक्रमण या स्वयं अणुओं से व्युत्पन्न संकेत करने के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं कि पता चलता है. दरअसल, TLR3 पाली की ligand साथ लिम्फ नोड stromal कोशिकाओं के इलाज (मैं: सी) में जिसके परिणामस्वरूप, प्रमुख उतक अनुरूपता जटिल वर्ग मैं अभिव्यक्ति और सह निरोधात्मक अणु पीडी-एल 1 के upregulation के एक मामूली upregulation लाती है, लेकिन नहीं costimulatory अणुओं की परिधीय ऊतक में नाटकीय परिवर्तन अभिव्यक्ति 19 प्रतिजनों. कई समूहों लिम्फ नोड stromal कोशिकाओं परिधीय ऊतक एंटीजन एक्सप्रेस और स्वयं प्रतिक्रियाशील टी कोशिकाओं 19,21-27 की सहिष्णुता प्रेरित दिखाया गया है. इसलिए, लिम्फ नोड stromal कोशिकाओं और अन्य प्रवासी और पुनः के बीच बातचीत को समझनेsident लिम्फ नोड कोशिकाओं में सूजन के दौरान सक्रियण या प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के दमन अनुमति देने के लिए नए लक्ष्य अणु खोजने में मदद मिलेगी. इसलिए, लिम्फ नोड के प्रकाशित एंजाइमी जुदाई के क्रियान्वयन की जरूरत है.
इससे पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल कम यांत्रिक तनाव 6,19,20 साथ collagenase आधारित enzymatic पाचन के विभिन्न संयोजनों का उपयोग करें. हालांकि, पाचन एंजाइमों या पाचन एंजाइम के विभिन्न संयोजन के साथ लंबे समय incubations सक्रियण स्थिति का विश्लेषण करने के लिए और नए लिम्फ नोड stromal कोशिकाओं की पहचान करने के लिए आवश्यक विभिन्न सतह अणुओं नीचा हो सकता है. Stromal सेल विश्लेषण के प्रकार पर निर्भर करता है, लिंक प्रोटोकॉल या फ्लेचर प्रोटोकॉल अधिक उपयुक्त हो सकता है. वर्णित प्रक्रिया में, एक से थोड़ा कम enzymatic पाचन व्यवहार्य लिम्फ नोड stromal कोशिकाओं की सतह मार्कर गिरावट को कम करने के लिए स्वचालित यांत्रिक disaggregation के साथ संयुक्त है. यह प्रक्रिया अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य अलगाव में सक्षम बनाता है औरकम परिवर्तनशीलता और 95% से अधिक व्यवहार्यता के साथ लिम्फ नोड stromal सेल आबादी का गौरव. हौसले से अलग लिम्फ नोड stromal कोशिकाओं सीधे विट्रो में कार्यात्मक assays के प्रदर्शन करने के लिए stromal कोशिकाओं लाइनों की सतह मार्कर अभिव्यक्ति, प्रोटीन विश्लेषण, और ट्रांसक्रिप्शनल पढ़ाई, साथ ही स्थापना के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
लिम्फ नोड stromal कोशिकाओं का अध्ययन हाल ही में कारण दो प्रकाशित पाचन प्रोटोकॉल 6,13 के विकास के लिए एक अनुसंधान ध्यान केंद्रित हो गया. दोनों प्रोटोकॉल एकल लिम्फ नोड stromal कोशिकाओं हासिल करने के लिए पर्याप्…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Sanjiv Luther and colleagues for helpful discussions in establishing the current lymph node digestion protocol. This work was supported by SNF grants PPOOA-_119204 and PPOOP3_144918 to S.W.R.
Materials
| DMEM | LifeTechnologies-Gibco | 41965-039 | |
| FCS | Final concentration 2% | ||
| CaCl2 | Sigma | 499609 | Final concentration 1.2 mM |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical Corporation | >160 units per mg dry weight, use at final concentration of 1 mg/ml | |
| Collagenase D | Roche | 11088882001 | use at 3.5 mg/ml |
| DNAse I | Roche | 11284932001 | use at 40 µg/ml |
| stiring magnets | FAUST | 5 mm long-2 mm ø | |
| Polystyren Round-Bottom Tubes 5ml | Falcon-BD Bioscience | ||
| Magnetic stirrer with heating funktion | IKA-RCT-standard | 9720250 | |
| Petridishes 100 mm, sterile | TPP | 6223201 | |
| 25G needles | Terumo | ||
| anti mouse CD45 Ab | Biolegend | Clone 30-F11 | |
| anti mouse CD11c Ab | Biolegend | Clone N418 | |
| anti mouse Podoplanin Ab | Biolegend | Clone 8.1.1 | |
| anti mouse CD31 Ab | Biolegend | Clone MEC13.3 | |
Eppendorf Xplorer plus, Multichannel |
Eppendorf | 4861 000.821/830 | 1.250 µl max. volume |
| anti mouse CD140a | Biolegend | Clone APA5 | |
| anti mouse CD80 | Biolegend | Clone 16-10A1 | |
| anti mouse CD40 | Biolegend | Clone 1C10 | |
| anti mouse I-Ab | Biolegend | Clone AF6-120.1 | |
| anti mouse CD274 (PD-L1) | Biolegend | Clone 10F.9G2 | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell stain kit | Invitrogen | L10119 |
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