In vivo avbildning av Dauer-spesifikke nevronale ombygging i C. elegans

Summary

Following exposure to specific environmental stressors, the nematode Caenorhabditis elegans undergoes extensive phenotypic plasticity to enter into a stress-resistant ‘dauer’ juvenile stage. We present methods for the controlled induction and imaging of neuroplasticity during dauer.

Abstract

Den mekanisme som kontrollerer stressindusert fenotypisk plastisitet hos dyr er ofte komplekse og vanskelige å studere in vivo. Et klassisk eksempel stress-indusert plastisitet er Dauer stadium av C. elegans. Dauers er en alternativ utviklingslarvestadiet dannet under betingelser med lave konsentrasjoner av bakterielle mat og høye konsentrasjoner av en Dauer feromon. Dauers vise omfattende utviklingsmessige og atferds plastisitet. For eksempel, et sett med fire inner-labial kvadranten (IL2Q) nevroner gjennomgå omfattende reversibel ombygging under Dauer formasjon. Ved hjelp av den kjente miljø trasé regulerings Dauer inngang, en tidligere etablert metode for produksjon av råolje Dauer feromon fra store væske nematode kulturer blir demonstrert. Med denne metoden en konsentrasjon på 50 000 – er tilstrekkelig til å produsere en høypotent råolje Dauer feromon 75,000 nematoder / ml væskekultur. Råoljen feromon potens er determined av en dose-respons bioassay. Endelig er de metodene som brukes for in vivo time-lapse avbildning av de IL2Qs under Dauer dannelse beskrevet.

Introduction

Fenotypisk plastisitet, inkludert utviklingsmessige og atferds plastisitet, er viktig for tilpasninger til ugunstige miljøforhold og regnes som en pådriver i utviklingen ^en. C. elegans er en modellorganisme ofte brukt for studier i utvikling og nevrobiologi. Under ideelle forhold, C. elegans utvikler gjennom fire larvestadier før inn i voksen reproduktive stadium. Men under forhold med lav mattilgang og høy befolkningstetthet, C. elegans kan gjennomgå en utviklings bryter og inngå en langlivet og stress-motstandsdyktig Dauer trinn ^2. Dauers vise flere morfologiske og atferdsmessige forskjeller fra ikke-dauers som sannsynlig megle denne stresstoleranse. De miljømessige signaler og genetiske trasé som regulerer Dauer oppføring har vært omfattende beskrevet ^{3, 4, 5, 6, 7.} Men de molekylære mekanismene som kontrollerer individuelle fenotypiske endringer som skjer during Dauer dannelse er mindre godt forstått.

Undersøkelsen av Dauer-spesifikke fenotyper krever produksjonen av Dauer dyr. Dette kan oppnås på tre forskjellige måter: 1) plukking fra en sultet kultur av C. elegans, 2) Bruk av Dauer dannelsen konstituerende (daf-c) mutanter, 3) Induksjon av Dauer dannelse gjennom renset feromon. Det er relativt enkelt å plukke dauers fra en standard NGM plate med en C. elegans befolkningen som har brukt opp sin bakteriell mat-forsyning. I våre hender, en standard NGM plate opprinnelig podet med 50 pl av OP50 Escherichia coli, tillatt å vokse i 3 dager og deretter inokulert med 3 – 4 voksne hermaphrodites holdt ved 25 ° C vil eksos maten tilførsel i løpet av en uke, og produserer flere tusen dauers innen en ekstra 3 dager (i tillegg til en rekke sultet ikke-dauers). Imidlertid er denne metode ikke tilfredsstillende for behandlingen av prosesser som forekommer i løpet av molt i dAuer. Det er vanskelig å avgjøre hvilke av de flere tusen dyr på en typisk sultet plate går inn i Dauer. Videre er bruk av en sultet plate gir ingen mulighet for synkronisering. Bruken av daf-c mutantene gjør det mulig for synkronisering og pålitelig generering av dauers. Imidlertid er det ingen garanti for at en bestemt daf-c mutasjon ikke vil påvirke andre Dauer-spesifikke fenotyper alene eller i kombinasjon med andre mutasjoner.

Tilstedeværelsen av en Dauer feromon ble først antydet av Cassada og Russell og senere demonstrert av gylne og Riddle. Den Dauer feromonet har siden blitt kjemisk preget ^{2, 8, 9, 10.} Det rensede feromon består av en kompleks blanding av ascarosides, som i forskjellige former regulere både atferdsmessige og utviklingsmessige prosesser ^{9, 11.} Anvendelse av en råolje Dauer feromon ekstrakt gir mulighet for pålitelig og kontrollert induksjon av synkroniserte dauers i et villtype-bakgrunn. </p>

Nervesystemet og tilhørende gliacellene gjennomgå ombygging under Dauer larve dannelse ^{12, 13, 14.} Noen av disse endringene er irreversible, slik som ombygging av gliaceller celler under Dauer ^{13, 14.} Men andre remodeling hendelser er reversible ved en retur til gunstig miljømessige forhold. For eksempel, et sett med fire IL2Q nevroner gjennomgå raske og reversible neuronal ombygging under Dauer dannelse inkludert: Dendritt arborization, en bryter fra enkelt dendrittiske til multidendritic nevroner og axon ombygging ^12. Fremgangsmåtene heri tillate pålitelige in vivo avbildning av stress-fremkalt neuroplasticity i modellorganisme. Metodene som presenteres for produksjon og testing av råolje Dauer feromon er som tidligere beskrevet og samlet fra flere kilder ^{4, 8, 15, 16, 17, 18.}

Protocol

1. Crude Dauer Pheromone Produksjon Grow OP50 E. coli fra en enkelt koloni O / N ved 37 ° C under rysting i 100 ml LB-næringsløsning ved 200 rpm. Merk Denne O / N kultur kan lages på forhånd og lagret ved 4 ° C. Grow N2 C. elegans på juni 15 til 20 cm petriskåler med agar NGM (Se oppskriften i tabell 1) podet med 50 pl av E. OP50 coli inntil bakterier er nesten tom 19. Gjør 5x 250 ml S media (se oppskrift i tabell 1) i 1 L Erlenmeyer …

Representative Results

Produksjon av råolje Dauer feromon resulterer i en gul væske (figur 1) som er både varme og kulde stabil. Aliquoter av råolje feromon er lagret ved -20 ° C ubestemt tid uten åpenbare tap i aktivitet. Etter produksjon av feromon, er en enkelt dose-respons-bioassay tilstrekkelig for et grovt estimat av styrken. Imidlertid, for de fleste eksperimenter er det nødvendig å gjenta bioassay 2-3 ganger og ta et gjennomsnitt fra hvert eksperiment. Representative resultater fra to feromon bioassay er gitt …

Discussion

En undersøkelse av Dauer spesifikke nevroplastisitet og andre Dauer-forbundet morfologiske endringer krever kontrollert og pålitelig dannelsen av dauers enten gjennom genetisk mutasjon (dvs., DAF-c mutanter) eller ved eksponering av vill type dyr til feromon. Mens bruken av en genetisk mutasjon for å indusere dauers er fordelaktig, kan det forvirre resultater. Derfor data samlet inn med daf-c mutasjoner skal senere bekreftet med vill-type dyr talt til å gå inn i Dauer scenen ved eksponering for Da…

Materials

N2 C. elegans Bristol strain	Caenorhabditis Genetics Center
PT2660 myIs13[Pklp-6::gfp] III	Upon request from Schroeder lab
PT2762 myIs14[Pklp-6::gfp] V	Upon request from Schroeder lab
JK2868 qIs56[Plag-2::gfp] V	Caenorhabditis Genetics Center
OP50 E. coli	Caenorhabditis Genetics Center
Petri dishes	Tritech Research	60 mm T3308, 35 mm T3501
NGM agar	Various		3 g NaCl, 17 g agar, 2.5 g peptone in 975 mL H2O autoclaved cooled to 55°C followed by 1 mL of 5 mg/ml cholesterol in ethanol, 25 mL of 1 M KPO4 buffer (pH 6.0), 1 mL of 1 M CaCl2, 1 mL of 1 M MgSO4
S Media	Various		S media consists of S basal solution (1.46 g NaCl, 0.25g K2HPO4, 1.5 g KH2PO4, 0.25 ml of 5 mg/ml cholesterol in ethanol and H2O to 250 mL. Autoclaved.) To the S basal solution add 2.5 mL of potassium citrate pH 6.0 (2 g citric acid monohydrate, 29.4 g tri-potassium citrate monohydrate, H2O to 100 mL, autoclaved), 2.5 mL of Trace Metals Solution (1.86 g disodium EDTA, 0.69 g FeSO4 •7 H2O, 0.2 g MnCl2•4 H2O, 0.29 g ZnSO4 •7 H2O, 0.025 g CuSO4 •5 H2O, H2O to 1 liter. Autoclaved and stored in the dark), 0.75 mL of 1 M CaCl2, and 0.75 mL of 1 M MgSO4.
Dauer pheromone plates for dose-response assay	Various		Mix 0.085 g Noble agar, 0.5 mL of 0.513 M NaCl and 5 µL of 5 mg/ml cholesterol dissolved in ethanol in each of 6x 15 mL culture tubes. Add sufficient crude pheromone to each tube to create a range of concentrations. Add H2O to bring the volume to 4.725 mL.  Boil over a Bunsen burner until the agar is dissolved and then cool to 55 °C. Add 125 µL 1 M KPO4 buffer (pH 6.0), 50 µl 0.1 M CaCl2, 50 µL 0.1 M MgSO4 and 50 µl of 5 mg/ml streptomycin sulfate to each tube.  Pour the contents of each tube into a 35 mm diameter Petri dish. Let the agar solidify at room temperature overnight (if longer, store in enclosed container to prevent excessive drying).
Microsphere beads 0.1 micron	Polysciences Inc.	00876-15
M9 buffer	Various		Mix 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 liter. Sterilize by autoclaving