सी में Dauer-विशिष्ट neuronal remodeling के vivo इमेजिंग में एलिगेंस
Summary
Following exposure to specific environmental stressors, the nematode Caenorhabditis elegans undergoes extensive phenotypic plasticity to enter into a stress-resistant ‘dauer’ juvenile stage. We present methods for the controlled induction and imaging of neuroplasticity during dauer.
Abstract
पशुओं में तनाव प्रेरित प्ररूपी plasticity नियंत्रित तंत्र विवो में अध्ययन करने के लिए अक्सर जटिल और मुश्किल है. तनाव प्रेरित plasticity की एक क्लासिक उदाहरण सी के Dauer चरण है एलिगेंस. Dauers बैक्टीरिया भोजन और एक Dauer फेरोमोन की उच्च सांद्रता की कम मात्रा की शर्तों के तहत गठित एक वैकल्पिक विकास लार्वा चरण हैं. Dauers व्यापक विकास और व्यवहार प्लास्टिसिटी प्रदर्शित करते हैं. उदाहरण के लिए, चार भीतरी ओष्ठ वृत्त का चतुर्थ भाग के एक सेट (IL2Q) न्यूरॉन्स Dauer गठन के दौरान व्यापक प्रतिवर्ती remodeling गुजरना. बड़े पैमाने पर तरल निमेटोड संस्कृतियों से कच्चे तेल Dauer फेरोमोन के उत्पादन के लिए प्रसिद्ध पर्यावरण रास्ते विनियमन Dauer प्रविष्टि, एक पहले से स्थापित विधि का उपयोग प्रदर्शन किया है. इस विधि के साथ 50,000 के एक एकाग्रता – तरल संस्कृति के 75,000 नेमाटोड / एमएल एक अत्यंत शक्तिशाली कच्चे Dauer फेरोमोन निर्माण करने के लिए पर्याप्त है. कच्चे तेल फेरोमोन शक्ति देते हैएक खुराक पर प्रतिक्रिया bioassay द्वारा rmined. अंत में, Dauer गठन के दौरान IL2Qs के vivo समय चूक इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया तरीकों से वर्णित हैं.
Introduction
विकास और व्यवहार प्लास्टिसिटी सहित प्ररूपी plasticity, पर्यावरण पर प्रतिकूल परिस्थितियों के रूपांतरों के लिए महत्वपूर्ण है और विकास 1 में एक प्रेरणा शक्ति माना जाता है. सी एलिगेंस अक्सर विकास और तंत्रिका जीव विज्ञान में अध्ययन के लिए इस्तेमाल एक मॉडल जीव है. आदर्श परिस्थितियों में, सी एलिगेंस वयस्क प्रजनन चरण में प्रवेश करने से पहले चार लार्वा चरणों के माध्यम से विकसित करता है. हालांकि, कम भोजन की उपलब्धता और उच्च जनसंख्या घनत्व, सी की शर्तों के तहत एलिगेंस एक विकासात्मक स्विच गुजरना और एक लंबे समय से रहते थे और तनाव प्रतिरोधी Dauer चरण 2 में प्रवेश कर सकते हैं. Dauers संभव है कि यह तनाव प्रतिरोध मध्यस्थता जो गैर dauers से कई रूपात्मक और व्यवहार मतभेद प्रदर्शित करते हैं. Dauer प्रवेश का विनियमन पर्यावरण cues और आनुवंशिक रास्ते बड़े पैमाने पर किया गया, 5, 4, 3, 6, 7 का वर्णन किया है. हालांकि, व्यक्तिगत प्ररूपी परिवर्तन को नियंत्रित करने के आणविक तंत्र घ होती है किuring Dauer गठन कम अच्छी तरह से समझ रहे हैं.
Dauer विशेष phenotypes की परीक्षा Dauer जानवरों के उत्पादन की आवश्यकता है. यह तीन तरह से पूरा किया जा सकता है: 1) सी के भूखे संस्कृति से उठा एलिगेंस, 2) Dauer गठन विधान (DAF-C) म्यूटेंट, शुद्ध फेरोमोन के माध्यम से Dauer गठन के 3) प्रेरण का प्रयोग करें. यह एक सी के साथ एक मानक एन जी एम थाली से dauers लेने के लिए अपेक्षाकृत आसान है इसके जीवाणु खाद्य आपूर्ति समाप्त हो गया है कि एलिगेंस आबादी. हमारे हाथ में, एक मानक एन जी एम थाली मूल रूप से 3 दिनों के लिए विकसित करने की अनुमति दी और बाद में 3 के साथ टीका OP50 Escherichia कोलाई के 50 μl, साथ वरीयता प्राप्त – 4 वयस्क hermaphrodites एक सप्ताह के भीतर खाद्य आपूर्ति निकास और कई हजार का उत्पादन होगा 25 डिग्री सेल्सियस पर रखा एक अतिरिक्त 3 दिनों के भीतर dauers (कई भूखे गैर dauers के अलावा). हालांकि, इस पद्धति डी में गिरना दौरान होने वाली की जांच प्रक्रियाओं के लिए असंतोषजनक हैAuer. यह Dauer में प्रवेश कर रहे हैं एक ठेठ भूखे प्लेट पर कई हजार पशुओं का जो तय कर पाना मुश्किल है. इसके अलावा, एक भूखे प्लेट का उपयोग तुल्यकालन के लिए कोई संभावना प्रदान करता है. DAF-C म्यूटेंट का उपयोग तुल्यकालन और dauers की विश्वसनीय पीढ़ी के लिए अनुमति देता है. हालांकि, एक विशेष DAF-C उत्परिवर्तन अकेले या अतिरिक्त परिवर्तन के साथ संयोजन में अन्य Dauer विशेष phenotypes को प्रभावित नहीं करेगा कि कोई गारंटी नहीं है.
एक Dauer फेरोमोन की उपस्थिति पहले Cassada और रसेल द्वारा गर्भित और बाद में गोल्डन और पहेली के द्वारा प्रदर्शन किया गया. Dauer फेरोमोन के बाद से रासायनिक, 10 9, 8, 2 की विशेषता किया गया है. शुद्ध फेरोमोन विभिन्न रूपों में 9, एक कच्चे Dauer फेरोमोन निकालने के 11. उपयोग के लिए अनुमति देता है दोनों व्यवहार और विकास की प्रक्रिया को विनियमित जो ascarosides का एक जटिल मिश्रण के होते हैं, एक जंगली प्रकार पृष्ठभूमि में सिंक्रनाइज़ dauers की विश्वसनीय नियंत्रित प्रेरण. </p>
तंत्रिका तंत्र और जुड़े glial कोशिकाओं Dauer लार्वा गठन 12, 13, 14 के दौरान remodeling गुजरना. इन परिवर्तनों से कुछ ऐसे Dauer 13, 14 के दौरान glia कोशिकाओं के पुनर्गठन के रूप में, अपरिवर्तनीय हैं. हालांकि अन्य remodeling घटनाओं अनुकूल करने के लिए एक वापसी पर प्रतिवर्ती हैं पर्यावरण की स्थिति. डेन्ड्राइट द्रुमायण, multidendritic न्यूरॉन्स और अक्षतंतु 12 remodeling के लिए एक वृक्ष के समान से एक स्विच: उदाहरण के लिए, चार IL2Q न्यूरॉन्स का एक सेट सहित Dauer गठन के दौरान तेजी से और प्रतिवर्ती न्यूरोनल remodeling गुजरना. तरीकों के साथ साथ एक मॉडल जीव में तनाव प्रेरित neuroplasticity की विश्वसनीय vivo इमेजिंग के लिए अनुमति देते हैं. उत्पादन और कच्चे Dauer फेरोमोन के परीक्षण के लिए प्रस्तुत तरीकों पहले कई स्रोतों 4, 8, 15, 16, 17, 18 से वर्णित और संकलित कर रहे हैं.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dauer विशेष neuroplasticity और अन्य Dauer जुड़े morphological परिवर्तन की एक परीक्षा से नियंत्रित है और या तो आनुवंशिक उत्परिवर्तन (यानी, DAF-C म्यूटेंट) के माध्यम से या फेरोमोन को जंगली प्रकार के पशुओं के जोखिम से dauers की विश्वसन…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
I thank Dr. Maureen Barr, under whose supervision the dauer IL2 remodeling phenotype was initially characterized. Thanks to Dr. C. Britt Carlson for critical reading of the manuscript. Funding in the Barr lab was from the NIH (5R01DK59418) and postdoctoral fellowships from the USDA (2010-65106-20587) and the New Jersey Commission on Spinal Cord Research (CSCR12FEL004). Current funding for this work is from a University of Illinois Urbana-Champaign College of ACES FIRE grant.
Materials
| N2 C. elegans Bristol strain | Caenorhabditis Genetics Center | ||
| PT2660 myIs13[Pklp-6::gfp] III | Upon request from Schroeder lab | ||
| PT2762 myIs14[Pklp-6::gfp] V | Upon request from Schroeder lab | ||
| JK2868 qIs56[Plag-2::gfp] V | Caenorhabditis Genetics Center | ||
| OP50 E. coli | Caenorhabditis Genetics Center | ||
| Petri dishes | Tritech Research | 60 mm T3308, 35 mm T3501 | |
| NGM agar | Various | 3 g NaCl, 17 g agar, 2.5 g peptone in 975 mL H2O autoclaved cooled to 55°C followed by 1 mL of 5 mg/ml cholesterol in ethanol, 25 mL of 1 M KPO4 buffer (pH 6.0), 1 mL of 1 M CaCl2, 1 mL of 1 M MgSO4 | |
| S Media | Various | S media consists of S basal solution (1.46 g NaCl, 0.25g K2HPO4, 1.5 g KH2PO4, 0.25 ml of 5 mg/ml cholesterol in ethanol and H2O to 250 mL. Autoclaved.) To the S basal solution add 2.5 mL of potassium citrate pH 6.0 (2 g citric acid monohydrate, 29.4 g tri-potassium citrate monohydrate, H2O to 100 mL, autoclaved), 2.5 mL of Trace Metals Solution (1.86 g disodium EDTA, 0.69 g FeSO4 •7 H2O, 0.2 g MnCl2•4 H2O, 0.29 g ZnSO4 •7 H2O, 0.025 g CuSO4 •5 H2O, H2O to 1 liter. Autoclaved and stored in the dark), 0.75 mL of 1 M CaCl2, and 0.75 mL of 1 M MgSO4. | |
| Dauer pheromone plates for dose-response assay | Various | Mix 0.085 g Noble agar, 0.5 mL of 0.513 M NaCl and 5 µL of 5 mg/ml cholesterol dissolved in ethanol in each of 6x 15 mL culture tubes. Add sufficient crude pheromone to each tube to create a range of concentrations. Add H2O to bring the volume to 4.725 mL. Boil over a Bunsen burner until the agar is dissolved and then cool to 55 °C. Add 125 µL 1 M KPO4 buffer (pH 6.0), 50 µl 0.1 M CaCl2, 50 µL 0.1 M MgSO4 and 50 µl of 5 mg/ml streptomycin sulfate to each tube. Pour the contents of each tube into a 35 mm diameter Petri dish. Let the agar solidify at room temperature overnight (if longer, store in enclosed container to prevent excessive drying). | |
| Microsphere beads 0.1 micron | Polysciences Inc. | 00876-15 | |
| M9 buffer | Various | Mix 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 liter. Sterilize by autoclaving |
References
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