This protocol details the reconstitution of light-harvesting complexes in vitro. These integral membrane proteins coordinate chlorophylls and carotenoids and are responsible for harvesting light in higher plants and green algae.
I växter och grönalger, är ljuset fångas upp av de ljus skörd komplex (LHCs), en familj av integrerade membranproteiner som samordnar klorofyller och karotenoider. In vivo, är dessa proteiner viks med pigment för att bilda komplex som är införda i thylakoid membranet i kloroplasten. Den höga likhet i de kemiska och fysikaliska egenskaperna hos medlemmarna i familjen, tillsammans med det faktum att de lätt kan förlora pigment under isoleringen, gör deras rening i ett naturligt tillstånd utmanande. Ett alternativt tillvägagångssätt för att erhålla homogena beredningar av LHCs utvecklades av Plumley och Schmidt 1987 1, som visade att det var möjligt att rekonstruera dessa komplex in vitro med början från renade pigment och ovikta apoproteiner, vilket resulterar i komplex med egenskaper mycket liknar den för infödda komplex. Detta öppnade vägen för användningen av bakteriella uttryckta rekombinanta proteiner för in vitro- </em> beredning. Rekonstituering metoden är kraftfull olika skäl: (1) rena beredningar av individuella komplexen kan erhållas, (2) pigmentkomposition kan kontrolleras för att bedöma deras bidrag till struktur och funktion, (3) rekombinanta proteiner kan muteras för att studera den funktionella rollen för de individuella rester (t.ex. pigmentbindningsställen) eller proteindomän (t.ex. protein-proteininteraktion, vikning). Denna metod har optimerats i flera laboratorier och appliceras på de flesta av de ljus skörd komplex. Protokollet som beskrivs här preciseras metoden för rekonstitution av ljus-skörd komplexen in vitro som för närvarande används i vårt laboratorium, och exempel som beskriver tillämpningar av metoden tillhandahålls.
Den fotosyntetiska apparaten i växter och alger ingår integrerade membranproteiner som binder klorofyll a (CHL a), b (chl b) och karotenoider (bil). Dessa pigment-proteinkomplex är aktiva inom skördeljusenergi och överföra denna excitationsenergi till reaktionscentra, där det används för att främja laddningsseparation 2. De är också involverade i regulatoriska återkopplingsmekanismer som skyddar fotosyntetiska apparaten från hög ljusskador 3,4. De lätta skörd komplex (LHCs) är sammansatta av en stor familj av besläktade proteiner i växter och alger 5.
Den homogena rening av varje familjemedlem har komplicerats av de mycket liknande kemiska och fysikaliska egenskaper komplexen. Dessutom reningsförfaranden resulterar ofta i förlust av pigment eller andra potentiella kofaktorer såsom lipider. In vitro rekonstituering reprets en kraftfull metod för att övervinna dessa problem. LHC förknippas med fotosystem II (LHC-II) först rekonstitueras in vitro genom Plumley och Schmidt i 1987 1. Forskarna extraherades avlipidiserade protein och pigment separat från växt kloroplaster, och sedan kombineras den värmedenaturerat protein med pigment i närvaro av litium Dodecyl Sulfate (LDS), följt av tre cykler av frysning och upptining 1. De visade att de spektrala egenskaperna hos de ombildade LHC komplexen var mycket lika komplex som renats från växter. Lättheten att rekonstituera LHC pigment-protein-komplex, sannolikt på grund av någon inneboende självsammansättning funktionen, tillsammans med svårigheten att isolera renade komplexen från organismer, ledde till ett snabbt antagande av metoden av andra forskare. Den beredning av fotosyntetiska proteiner överuttryckt i Escherichia coli (E. coli) uppnåddes genom Paulsen och kollegor 1990 6. I E.coli, överuttryckta membranproteiner är i regel förpackat i inklusionskroppar, vilka anläggningar deras renings. Rekonstitution åstadkommes genom värmedenaturering av de inklusionskroppar innehållande rekombinant protein i närvaro av LDS, följt av tillsats av pigment, vilka initierar proteinveckning. Vikning av LHCII komplexet är en två-stegsprocess: först, är klorofyll a bunden på mindre än 1 min; andra, klorofyll b bunden och stabiliserades under flera minuter 7.
Förutom att ge en inblick i de fällbara dynamik, in vitro-beredning i kombination med riktad mutagenes har tillåtit att identifiera specifika aminosyror som är viktiga för stabiliteten (t.ex. 8,9) eller pigment samordning (t.ex. 10). Manipulering av återveck villkor genom att justera parametrar såsom pigmentsammansättning eller tvättmedel har också identifierat element critical för korrekt vikning, exempelvis kravet på xantofyller för LHCII komplexet (t.ex. 1,11). Dessutom har undersökningen av egenskaperna hos de enskilda pigmenten som är bundna till de komplex som varit möjligt med användning av komplexen rekonstitueras in vivo (t ex 10).
Den metod som beskrivs här börjar med isolering av pigment (klorofyller och karotenoid) från spenat och den gröna algen Chlamydomonas reinhardtii. Uttrycket och rening av LHC protein från E. coli i form av inklusionskroppar därefter detalj, följt av beredning av LHC och efterföljande rening genom Ni-affinitetskolonn. I det slutliga steget, är de rekonstituerade komplexen renades ytterligare genom sackaros-gradientcentrifugering för att avlägsna fria pigment och ovikt apoprotein. Detta protokoll utgör en optimerad förfarande innehåller flera ändringar som har införts av olika laboratorier övertid 1,6,10,12 -14.
Membranproteiner är inte så lätt att studera. Isolering av nativa membranproteiner kompliceras av behovet att lösa lipidbilagret med rengöringsmedel, vilket kan skada proteinet och ta bort viktiga kofaktorer. Dessa proteiner kan också vara närvarande i låga halter i biologiska membran, eller blandas med närbesläktade proteiner, som i fallet av de lätta skörd komplexen, som gör rening av enstaka komplex svåra. Heterolog proteinexpression i E. coli och in vitro-beredning erbjuder möjligheten att undvika dessa problem. In vitro beredning och rening av vikta proteiner leder komplex som besitter egenskaper som mycket liknar de hos de infödda komplex 20,21,23 och därmed kan användas för att studera komplex som inte kan renas till homogenitet 24 – 27.
Den här metoden använder spenat, som är lätt attainable året runt, som en källa för den totala pigment och karotenoidpreparat. För vissa reconstitutions av proteiner nativa för alger, är användningen av pigment som renats från alger föredrages på grund av olika pigmentkompositioner. CHL a / b-förhållande och Chl / bil förhållandet är detsamma oavsett pigmentkälla.
Det är viktigt att inse att effektiviteten i beredning är vanligtvis runt 35% 28. Därför är det nödvändigt att avlägsna de icke bundna pigment och ovikt apoprotein från lösningen efter beredning. Ett två-stegs reningsprotokoll presenteras i detta protokoll (se även resulterar). Emellertid bör det noteras att den sackarosgradient steg inte medger fullständig separation av apo-och holo-proteinet. För de flesta analyser är detta inte ett problem, eftersom det apoprotein inte innehåller pigment och sålunda inte stör de funktionella mätningar. Men det är nödvändigt om att helt ta bort apoprotein från frhandling som innehåller den färdigberedda komplexet (till exempel för att beräkna pigmentet till protein stökiometri), kan en anjonisk bytarkolonn användas (se Passarini et al. 2009 29 för mer information).
Förmågan att återvecka rekombinanta ljus skörd proteiner med isolerade pigment in vitro ger en möjlighet att "manipulera" komplexen genom att modifiera beredning "miljö" på olika sätt och på så sätt ändrar egenskaperna hos det resulterande komplexet. Till exempel kan ändra pigmentkompositionen under rekonstitution resulterar i ett komplex med förändrad pigmentkomposition. Den här funktionen kan användas för att studera inverkan av olika pigment har på strukturen och stabiliteten av komplexet. Vanligtvis pigmentet preparaten av spenat har Chl a / b förhållande på 3: 1 och en Chl / bil-förhållande på 2,9: 1. Detta förhållande ger typiskt en rekonstituerad protein med samma egenskaper som de ntivt en. Emellertid kan justeringen av Chl a / b-förhållande genom tillsättning av renat Chl a eller b påverka bindningen av olika pigment på grund av varierande selektivitet av bindningsställena 30-33. Detta är möjligt eftersom de flesta av de pigmentbindningsställen inte är helt selektiva för Chl a eller Chl b, men rymmer båda, fastän med olika affinitet 10,30,34. På ett liknande sätt, var karotenoid bindningsställen också visat att kunna rymma mer än en xantofyll arter 8,35 – 38. Olika reconstitutions av CP26, ett annat pigment-protein-komplex av högre växter, genom att använda olika pigmentkompositioner visas i tabell 2 39. Dessa reconstitutions användes för att utvärdera affiniteten för bindningsställen för specifika pigment 39. Det är intressant att notera att i syfte att erhålla ett komplex med samma pigment cSAMMANSÄTTNING som det nativa ett måste Chl a / b förhållandet mellan pigment mix vara 3: 1. Detta verkar vara fallet för alla LHC komplex av högre växter 20,40.
Kombinationen av molekylärbiologi med beredning teknik medger egenskaperna för en Chl bindande komplex som ska studeras mer i detalj. Betydelsen av olika proteindomäner på stabiliteten och vikning av komplexen, eller deras engagemang i de protein-proteininteraktioner, har fastställts genom att trunkera apoprotein eller utför slumpmässig mutagenes 8,41 – 44. Single aminosyror viktiga för samordningen av olika pigment kan förändras genom riktad mutagenes för att analysera egenskaperna hos enskilda pigment eller bedöma deras bidrag till funktion och stabilitet i komplexa 10,28,29,45 – 52. Figur 6 visar rekonstituerade Lhcb4 (CP29) meden mutation av histidin vid position 216 53. En jämförelse av pigmentkompositionen av vildtyp och mutanta komplex visar att mutationen inducerar förlusten av ett Chl en molekyl, vilket indikerade att den målsökta platsen rymmer ett Chl en i WT-komplexet. Skillnaderna i absorptionsspektra för WT och mutant, upon normalisering till pigmentinnehåll, visar också på absorptionsegenskaperna för den förlorade pigmentet. I detta fall kan skillnaden ses i huvud toppen vid 680 nm, vilket indikerar att Chl ett samordnat av His216 absorberar vid denna våglängd (för mer information om denna mutant och spektroskopiska egenskaper ser Mozzo et al. 2008 53). Mutationsanalys kan också användas för att bestämma effekten av miljön på de spektroskopiska egenskaperna hos pigmenten 54.
Sammanfattningsvis kan lätta skörd proteiner lätt beredas in vitro resulterar i pigment-protein komplex med mycket liknande egenskaper som infödda komplex. På detta sätt är svårigheterna att isolera naturliga proteiner elimineras, samtidigt leverera proteinpreparat med högt utbyte och renhet för vidare studier. Vikten av en 3: 1 Chl a / b-förhållandet i producera en autentisk komplex betonas, och exempel på rekonstituerad vildtyp och mutanta LHCs tillhandahålls för att illustrera tillämpningar av tekniken.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the European research council by a ERC starting/consolidator grant to RC and by the Dutch Foundation for research on matter (FOM) via a FOM program (10TM01).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
HisTrap HP | GE Healthcare | 17-5247-01 | |
Nylon cloth | 20 μm pores | ||
Soft artists paint brush | |||
NONIDET P-40 | Sigma | 74385 | |
Beta-DM | Sigma | D4641 | |
DNAase | ThermoScientific | EN0525 | |
Milk Powders | |||
RNAase | ThermoScientific | EN0531 | |
Sonicator | |||
Octyl β-D-glucopyranoside | Sigma | O8001 | |
Ultracentrifuge XL | Beckman-Coulter | ||
TAP medium | see reference 17 | ||
LB medium | see reference 19 |