Murine वाल्व endothelial कोशिकाओं का अलगाव
Summary
The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.
Abstract
Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.
Introduction
परिपक्व वाल्व हृदय वाल्व endothelial कोशिकाओं (VECs) 1 की एक परत द्वारा विशेष कोशिकी वाल्व बीचवाला कोशिकाओं (Vics) के साथ interspersed मैट्रिक्स (ईसीएम) और समझाया की तीन स्तरीकृत परतों से बना है. ईसीएम की भूमिका हृदय चक्र के दौरान hemodynamic बल में निरंतर परिवर्तन का सामना करने के लिए सभी आवश्यक biomechanical गुण प्रदान करना है. वयस्क वाल्व में वाल्व ईसीएम का कारोबार कसकर काफी हद तक मौन और रोग की अनुपस्थिति में fibroblast की तरह कर रहे हैं कि Vics द्वारा नियंत्रित किया जाता है. विक जनसंख्या के अलावा, हृदय वाल्व endothelial कोशिकाओं (VECs) वाल्व cusps 2 की सतह पर एक निरंतर अन्तःचूचुक के रूप में. वाल्व संरचना और समारोह के लिए ईसीएम और Vics के महत्व को हमें और दूसरों के द्वारा वर्णित किया गया है, VECs की भूमिका कम अच्छी तरह से जाना जाता है. हालांकि, इस अपेक्षाकृत छोटे सेल आबादी भ्रूण में वाल्व गठन के लिए महत्वपूर्ण है और वाल्व में बेकार के रूप में वर्णित किया गया हैरोग.
Atrioventricular नहर और बहिर्वाह पथ क्षेत्रों के भीतर endothelial कोशिकाओं के एक सबसेट mesenchymal परिवर्तन (EMT) और endocardial तकिये 1,3 के रूप में जाना जाता फार्म सूजन को endothelial गुजरना जब भ्रूण में हृदय वाल्व गठन शुरू होता है. इन संरचनाओं के भीतर नव तब्दील mesenchymal कोशिकाओं बाद में VICS में अंतर और परिपक्व वाल्व के रूप में. EMT पूरा हो गया है एक बार, कुशन आसपास के endothelial कोशिकाओं, VECs करार दिया चोट के खिलाफ परिपक्व वाल्व की रक्षा करता है कि एक निरंतर endothelial सेल परत के रूप में. इसके अलावा, VECs hemodynamic पर्यावरण भावना और ईसीएम 1,3 homeostasis को विनियमित करने के लिए अंतर्निहित Vics साथ संवाद molecularly दिखाया गया है. रोगग्रस्त वाल्व में, ग्राम शिक्षा समिति के monolayer ईसीएम संगठन में असामान्य परिवर्तन और बायोमेकेनिक्स 4,5 के सहयोग से बाधित है. इसके अलावा, माउस मॉडल में पढ़ाई ग्राम शिक्षा समिति में शिथिलता वाल्व डी का मूल कारण है कि सुझाव हैisease 1,6-9. VECs वाल्व विकास, रखरखाव, और रोग में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, यह हम पूरी तरह से क्षेत्र अग्रिम और रोग के तंत्र को समझने के क्रम में उनके अस्थायी phenotypes को परिभाषित है कि महत्वपूर्ण है.
कई प्रयोगशालाओं द्वारा पिछले काम को सफलतापूर्वक सुअर और ovine मॉडल 10-12 से VECs अलग है. कारण ये वाल्व के बड़े आकार के लिए, चुंबकीय मनका सेल जुदाई और एकल कक्ष क्लोनल विस्तार शुद्ध आबादी 11-13 उत्पन्न करने के लिए प्रभावी किया गया है सहित विभिन्न अलगाव तरीकों की एक संख्या के बाद, swabbing और / या enzymatic पाचन के माध्यम से isolations. हालांकि, इन मॉडलों की वजह से उच्च लागत के अलावा आणविक उपकरणों की उपलब्धता सीमित सुअर और भेड़ जीनोम का अधूरा टिप्पणी करने के लिए प्रतिबंधात्मक हो सकता है. इसलिए अलगाव के बाद सुअर और ovine VECs का प्रयोग प्रतिबंधात्मक हो सकता है. माउस मॉडल कारण आनुवंशिक manipula लिए कई संभावनाओं को बेहतर कर रहे हैंtion और भ्रूण और वयस्क में आणविक उपकरण, लेकिन आज तक, छोटे पशु मॉडल में कोई ग्राम शिक्षा समिति isolations सूचित किया गया है. इस वजह से फिलहाल जिससे एंटीबॉडी आधारित अलगाव तरीकों को रोकने, ग्राम शिक्षा समिति के विशेष मार्कर की अद्वितीय पहचान की कमी है कि एक अल्पसंख्यक सेल की आबादी शामिल है कि छोटे ऊतकों के नमूनों के साथ काम करने की कठिनाई होने की संभावना है.
इस अनुच्छेद में, हम भ्रूण और वयस्क चरणों में murine VECs के प्रत्यक्ष अलगाव के लिए एक नई विधि की रिपोर्ट. इस प्रोटोकॉल सभी endothelial प्रकार की कोशिकाओं में व्यक्त GFP और बड़े पैमाने पर endothelial सेल आबादी 14 अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है जो Tie2-GFP चूहों, का लाभ लेता है. हालांकि, इस मौजूदा अध्ययन की नवीनता के लिए पहली बार इन चूहों, वाल्व से endothelial कोशिकाओं को अलग करने के लिए उपयोग किया गया है. वाल्व ऊतक और FACS छँटाई के द्वारा पीछा नौ एंजाइमी digestions की एक श्रृंखला से सावधान विच्छेदन करके, VECs अलग किया जा सकता है और में विभिन्न प्रयोगात्मक तकनीक के लिए इस्तेमाल कियासीधे छँटाई के बाद, शाही सेना निष्कर्षण और संस्कृति समेत.
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ हम पहली बार वर्णन, Tie2-GFP चूहों से भ्रूण और वयस्क murine VECs के अलगाव के लिए एक उपन्यास विधि. इस माउस लाइन बड़े पैमाने पर endothelial सेल आबादी के अलगाव के लिए इस्तेमाल किया गया है, वहीं इस VECs के चयनात्मक अलगाव दिखा पहली रिपोर्ट है. कारण ग्राम शिक्षा समिति आबादी की कमजोरी के कारण, हम भ्रूण और वयस्क चूहों के हृदय वाल्व से सकारात्मक GFP (और GFP नकारात्मक) कोशिकाओं के एकल कक्ष अलगाव के लिए अनुमति देता है कि एक कड़े प्रोटोकॉल विकसित किया है. Tie2-GFP चूहों 14 से पूरे भ्रूण या अंगों का उपयोग मूल प्रकाशन की तुलना में, हम कोशिकाओं के एक चुनिंदा आबादी को अलग करने के लिए इस नाजुक endothelial सेल की आबादी का कम बहुतायत के आधार पर collagenase और विच्छेदन कदम अनुकूलित है.
ग्राम शिक्षा समिति के isolations पहले से ही सीमित आनुवंशिक और biomolecular उपकरणों के साथ बड़े पशु मॉडल में सूचित किया गया है. ये उपकरण ठीक है, इसलिए अबी चूहों में स्थापित किया है और कर रहे हैंmurine VECs को अलग करने में lity हृदय वाल्व अनुसंधान के लिए प्रयोग की जाने वाली प्रयोगात्मक डिजाइन की एक विस्तृत सेट के लिए अनुमति देता है. इसलिए, इस दृष्टिकोण का एक महत्वपूर्ण फायदा VECs जंगली प्रकार चूहों, और वाल्व रोग और चोट के मॉडल से अस्थायी अलग किया जा सकता है. एक दूसरा फायदा VECs पृथक और अधिक सही vivo में स्थिति को प्रतिबिंबित कि अभिव्यक्ति पैटर्न के संरक्षण, विच्छेदन के बाद लगभग तुरंत विश्लेषण किया जा सकता है. इसके अलावा, इस अलगाव प्रोटोकॉल संख्या विस्तार और इन विट्रो वातावरण से प्रेरित इसलिए संभावित प्ररूपी परिवर्तन के लिए रोका जाता है सेल संस्कृति को खत्म करने के लिए पर्याप्त है.
सस्ता माल और इस प्रोटोकॉल की प्रयोगात्मक लाभ के बावजूद, हम सीमाओं अभी भी मौजूद है कि पहचान. सबसे पहले, murine वाल्व के भीतर ग्राम शिक्षा समिति की आबादी का आकार बहुत छोटा है और इसलिए, कई समय भ्रूण litters जीन अभिव्यक्ति के विश्लेषण के लिए पर्याप्त आरएनए उत्पन्न करने के क्रम में जरूरत है. थी जबकिएस कई प्रजनकों का उपयोग कर दूर किया जा सकता है, यह कुछ के बाद अलगाव विश्लेषण उपकरण के प्रार्थना पत्र पर असर हो सकता है. इस सीमा विशेष रूप से आणविक प्रोफाइल और कार्यात्मक assays सहित ग्राम शिक्षा समिति phenotypes की अधिक गहन विश्लेषण प्रदर्शन करने के क्रम में GFP पॉजिटिव VECs का मिला हुआ संस्कृतियों की स्थापना के लिए एक चुनौती रहा है. इसलिए हम नहीं सभी कठिनाइयों हमारे दृष्टिकोण से दूर किया गया है कि को स्वीकार करते हैं, लेकिन यह हम पर काबू पाने के लिए प्रयास कर रहे हैं कि ब्याज की एक क्षेत्र है.
वाल्वुलर क्षेत्रों से VECs अलग करने का यह दृष्टिकोण निलय मायोकार्डियम के भीतर endocardium, या संवहनी संरचनाओं के गठबंधन GFP -positive, गैर वाल्वुलर endothelial कोशिकाओं से संदूषण की संभावना का परिचय. तिथि करने के लिए, अन्य हृदय endothelial सेल आबादी से VECs की आणविक भेद की पहचान नहीं की गई है. हालांकि Nfatc1 जीन की एक बढ़ाने क्षेत्र की पहचान की है और विशेष रूप से है कि नहीं VECs लेबल करने के लिए दिखाया गया हैदिल 18 के भीतर EMT, और कोई अन्य endothelial सेल जनसंख्या से गुजरना. एक Cre मॉडल (Nfatc1 enCre) उपलब्ध है, भविष्य के अध्ययन संदूषण जोखिम को कम करने के लिए इस लाइन की विशिष्टता का उपयोग कर सकता है. गैर वाल्वुलर Tie2-GFP- सकारात्मक कोशिकाओं के अलावा, वाल्व पत्रक सेप्टल और भित्ति दौरे दीवारों के कुंडलाकार क्षेत्र को देते हैं जहां बिंदु पर myocytes से संदूषण की संभावना हमेशा वहाँ है. यहाँ नहीं दिखाया डेटा में, हम शुरू में विरोधी GFP और विरोधी CD31 के साथ लेपित एंटीबॉडी संयुग्मित मनकों का उपयोग विच्छेदित वाल्वुलर क्षेत्रों से VECs अलग करने के लिए अध्ययन शुरू किया. इस दृष्टिकोण endothelial कोशिकाओं के लिए अलग सफल रहा था, वहीं हम आसन्न, गैर endothelial सेल प्रकार से महत्वपूर्ण सेल clumping अनुभवी और इसलिए Vics और मायोकार्डियल कोशिकाओं हमारे प्रयोगात्मक नमूने दूषित. इस मापदंडों केवल एकल कक्ष निलंबन को अलग करने के लिए निर्धारित किया गया है के रूप में FACS विश्लेषण का उपयोग से परहेज किया गया हैएस और पीसीआर विश्लेषण myocyte विशिष्ट जीन की अभिव्यक्ति इस सीमा (चित्रा 3) के लिए नियंत्रित किया गया है पता लगाने के लिए. हमारे संदूषण न्यूनतम के रूप में समझा जा सकता है, यह GFP और endothelial सेल विशिष्ट सतह मार्कर की डबल चयन के साथ भविष्य में बचा जा सकता है जो एक संभावित प्रयोगात्मक जटिलता बनी हुई है.
इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना, हम भ्रूण और वयस्क चूहों और इस दृष्टिकोण शाही सेना अलगाव और GFP सकारात्मक और GFP नकारात्मक सेल आबादी के सेल संस्कृति के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की दिए गए उदाहरणों से सफलतापूर्वक अलग VECs है. हालांकि, इस दृष्टिकोण इन आवेदनों तक सीमित नहीं है और, आणविक सेलुलर और कार्यात्मक दृष्टिकोण के ढेर सारे के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, Tie2-GFP पृष्ठभूमि स्वास्थ्य और रोग में ग्राम शिक्षा समिति की आबादी के तुलनात्मक अध्ययन के लिए अनुमति देगा कि आनुवंशिक माउस मॉडल के साथ नस्ल जा सकता है. इस उपन्यास पद्धति का विकास, पहली बार के लिए, ध्यान केंद्रित अध्ययन के लिए अनुमति देगावाल्व विकास और रखरखाव में VECs के योगदान की जांच और endothelial निर्भर वाल्व रोग का पहले से नाचीज तंत्र प्रकट कर सकता है.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम FACS विश्लेषण के साथ तकनीकी सहायता के लिए ओहियो स्टेट यूनिवर्सिटी व्यापक कैंसर केंद्र विश्लेषणात्मक Cytometry कोर सुविधा, विशेष रूप से कैटरीना मूर, धन्यवाद. इसके अलावा हम अपने वैज्ञानिक अंतर्दृष्टि के लिए डॉ विलियम पु और उनके समूह को पहचानते हैं. यह काम एनआईएच HL091878 (जीएल) और राष्ट्रव्यापी बच्चों के अस्पताल में हार्ट केंद्र द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| [header] | |||
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rat IgG (H+L) | Life Technologies | A-11077 | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| 2.5% Trypsin | Invitrogen LT | 15090-046 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, Heat Shock Treated | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| CD31 rat anti-mouse antibody | BD Pharmingen | 553370 | |
| Chick Serum | Invitrogen LT | 16110-082 | |
| Collagenase IV | Invitrogen LT | 17104-019 | Prepared according to manufactuer's instructions |
| DNase I, RNase free (10,000 Units) | Roche | 4716728001 | |
| EBM-2 | Lonza | CC3156 | For VEC media |
| EDTA, 0.5M Solution | Hoefer | 03-500-506 | |
| EGM2 SingleQuot, Bulletkit | Lonza | CC-4176 | For VEC media |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Hyclone | SH3007103IH | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14025-092 | |
| Horse Serum | Invitrogen LT | 16050-130 | |
| Hybridization Oven | VWR | 230301V | |
| Medium 199 1X | Corning Cell gro | 10-060-CV | |
| Paraformaldehyde 16% Solution EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Pen/Strep | MP-Biomed | ICN1670049 | |
| Permanox sterile chamber slide with cover | Thermo-Scientific | 177429 | |
| Phosphate-Buffered Saline, 1X | Corning Cell gro | 21-040-CV | |
| PrimeTime Mini qPCR Assay | Integrated DNA Technologies | Acta2 (αSMA), GAPDH, Myh6, Myh7, POSTN, CD31, vWF | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
| SuperScript VILO Mastermix | Invitrogen LT | 11755050 | |
| Tie2-GFP mice | Jackson Laboratories | 3658 | |
| Tissue forceps #5 11cm | Dumont | 14096 | |
| Trizol | Ambion | 15596018 | |
| α-SMA anti-mouse antibody | Sigma-Aldrich | A2547 | |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 |
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