लगातार और व्यापक Neuronal पारगमन के लिए नवजात माउस ब्रेन की Intracerebroventricular वायरल इंजेक्शन
Summary
Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.
Abstract
वैज्ञानिक उन्नति की गति तेजी में तेजी के साथ, नए तरीकों को जल्दी और आसानी से माउस मस्तिष्क में जीन अभिव्यक्ति में हेरफेर करने के लिए प्रायोगिक तंत्रिका विज्ञान के लिए आवश्यक हैं. यहाँ हम पहले नवजात माउस मस्तिष्क में virally इनकोडिंग transgenes की प्रत्यक्ष intracranial वितरण के लिए Passini और वोल्फ ने शुरू की एक तकनीक का वर्णन. इसकी सबसे बुनियादी रूप में, प्रक्रिया केवल एक बर्फ बाल्टी और एक microliter सिरिंज की आवश्यकता है. हालांकि, प्रोटोकॉल भी तकनीक के लिए नए शोधकर्ताओं के लिए स्थिरता में सुधार करने के लिए stereotaxic फ्रेम के साथ प्रयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता. विधि ependymal अस्तर अभी भी जन्म के बाद पहले 12-24 घंटे के दौरान अपरिपक्व है, जबकि मस्तिष्क पैरेन्काइमा में मस्तिष्क निलय से आसानी से ले जाने के लिए एडिनो से जुड़े वायरस (एएवी) की क्षमता पर निर्भर करता है. मस्तिष्क भर में न्यूरॉन्स की व्यापक पारगमन में इस उम्र के परिणाम पर एएवी की intraventricular इंजेक्शन. अभिव्यक्ति इंजेक्शन के दिनों के भीतर शुरू होता है और lifetim के लिए बनी रहती हैपशु की ई. वायरल अनुमापांक एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन की सह अभिव्यक्ति transduced कोशिकाओं का एक महत्वपूर्ण लेबल प्रदान करता है, जबकि transduced न्यूरॉन्स के घनत्व को नियंत्रित करने के लिए समायोजित किया जा सकता है. दोनों मुस्तैद, पूर्व पैक अभिकर्मकों और कस्टम वायरल तैयारी प्रदान करने के लिए वायरल कोर सुविधाओं की बढ़ती उपलब्धता के साथ, इस दृष्टिकोण, जल्दी आसान है, और अब तक कम महंगा है कि माउस मस्तिष्क में जीन अभिव्यक्ति जोड़ तोड़ के लिए एक समय पर विधि प्रदान करता है पारंपरिक germline इंजीनियरिंग से.
Introduction
तंत्रिका जीन अभिव्यक्ति को संशोधित करने के लिए पारंपरिक तरीकों समय लेने वाली और महंगा germline जोड़तोड़ की आवश्यकता होती है. नोवो डे वैकल्पिक तेजी से परिणाम और कम महंगे हैं, लेकिन जटिल शल्य चिकित्सा हस्तक्षेप 1-3 की आवश्यकता का नुकसान है utero electroporation या stereotaxic lentiviral इंजेक्शन के रूप में इस तरह के दृष्टिकोण. इसके अलावा, transgene अभिव्यक्ति इन तरीकों के साथ एक सीमित स्थानिक रेंज है. इस के साथ साथ, हम नवजात माउस मस्तिष्क में एडिनो से जुड़े वायरस (एएवी) की intraventricular इंजेक्शन के माध्यम से बड़े पैमाने पर न्यूरोनल हेरफेर के लिए एक तेज, आसान, और किफायती विधि का वर्णन. विधि प्रथम, एएवी यह अपरिपक्व ependymal बाधा के माध्यम से और मस्तिष्क पैरेन्काइमा 4 में पार्श्व निलय से गुजरता के रूप में यह मस्तिष्क रीढ़ की हड्डी में तरल पदार्थ के भीतर फैलाना करने की अनुमति के वे छोटे कण आकार सुझाव दिया जहां 2001 में जॉन वोल्फ और मार्को Passini द्वारा वर्णित किया गया था 5. च भीतर एएवी की intraventricular इंजेक्शनirst जन्म पैदावार घ्राण बल्ब से ब्रेन स्टेम 6,7 करने के लिए, मस्तिष्क के हर क्षेत्र में फैले तंत्रिका कैंपेन्स के व्यापक वायरल पारगमन के बाद 24 घंटे. Virally दिया transgenes व्यक्त की और इंजेक्शन के दिनों के भीतर सक्रिय और पारगमन के बाद एक साल तक के लिए जारी रहती हैं. इस प्रकार, इस बहुमुखी हेरफेर जल्दी प्रसव के बाद मस्तिष्क के विकास से वयस्क में उम्र बढ़ने और अध: पतन से लेकर पढ़ाई में सक्षम बनाता है.
यह न्यूरॉन्स 6 transducing में सबसे कारगर है क्योंकि हमारे विशिष्ट प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के तकनीक आदत डाल में, हम मुख्य रूप से AAV8 सीरोटाइप पर ध्यान केंद्रित किया है. हम वायरल अनुमापांक आनुवंशिक हेरफेर के प्रयोगों का परीक्षण सेल आंतरिक परिणामों के लिए transduced न्यूरॉन्स के घनत्व को नियंत्रित करने के लिए पतला किया जा सकता है. इसके अलावा, हम दो वायरस के लिए चुना सीरमप्रकारों पर निर्भर करता है, न्यूरॉन्स के विशिष्ट या अतिव्यापी सेट के प्रति पक्षपाती रहे हैं कि अभिव्यक्ति पैटर्न का उत्पादन करने के लिए सह इंजेक्शन जा सकता है कि दिखानावायरल पैकेजिंग. हमारा काम प्रयोगात्मक न्यूरोसाइंस सेटिंग्स की एक विस्तृत श्रृंखला में प्रयोग के लिए इस तकनीक का बहुमुखी प्रतिभा का विस्तार.
Protocol
Representative Results
Discussion
हम नवजात माउस मस्तिष्क में बड़े पैमाने पर वितरण के लिए एक वाहन के रूप में एएवी का उपयोग neuronal जीन अभिव्यक्ति जोड़ तोड़ के लिए एक बहुमुखी प्रक्रिया का वर्णन किया है. ऐसे utero electroporation 1 या stereotaxic intracranial इंजेक्शन <su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by the Robert A. and Rene E. Belfer Family Foundation, NIA R21 AG038856 (JLJ), BrightFocus Foundation Alzheimer’s Disease research grant A2010097 (JLJ), and NIA Biology of Aging Training grant T32 AG000183 (support for SDG).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| ICR outbred mice | Harlan | Hsd:ICR (CD-1) | This strain is also known as CD-1 |
| FVB inbred mice | The Jackson Laboratory | 1800 | 5-6 weeks of age |
| Nestlets | Lab Supply | NESTLETS | |
| Shepherd shacks | Lab Supply | SS-mouse | |
| High fat rodent chow | Purina Mills | PicoLab Mouse diet 20, #5058 | This is our standard breeder chow |
| High fat rodent chow (alternative) | Harlan Laboratories | Teklad Global 19% protein rodent diet #2019S | If low phytoestrogen, autoclavable diet is needed |
| Injection syringe | Hamilton | 7653-01 | 10 ml syringe |
| Injection needles | Hamilton | 7803-04, RN 6PK PT4 | 32 gauge, for standard P0 injections |
| Metal plate for cryoanesthesia | McMaster Carr | 8975K439 | Raw aluminum plate, 6” x 12”, 0.25” thick, will need to be cut into 3 equal pieces and edges sanded by local machine shop |
| Small animal stereotaxic device with digital readout | David Kopf Instruments | Model 940 | |
| Universal syringe holder with needle support foot | David Kopf Instruments | Model 1772-F1 | |
| Neonatal frame | Stoelting | 51625 | Officially called a mouse and neonatal rat adaptor |
| Biohazard disposal bags with sterile indicator | VWR | 14220-030 | Important! – Check with local veterinary and environmental safety staff to learn your institute’s protocol for biohazard waste disposal |
References
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