माउस मस्तिष्क के विभिन्न क्षेत्रों में टेलोमिरेज गतिविधि: गैर रेडियोधर्मी टेलोमिरेज प्रवर्धन प्रोटोकॉल दोहराएँ (ट्रैप) परख
Summary
Telomerase is expressed in the neonatal brain and also in distinct regions of the adult brain. We present a non-toxic time saving TRAP assay for the analysis of telomerase activity in various regions of the mouse brain and detection of differences in telomerase activity between male and female mouse brains.
Abstract
टेलोमिरेज, एक Ribonucleoprotein, टेलोमेर की लंबाई को बनाए रखने और इसलिए जीनोमिक अखंडता, प्रसार, और उम्र को बढ़ावा देने के लिए जिम्मेदार है. ऐसे न्यूरॉन्स के रूप में गैर mitotic, अत्यधिक सक्रिय कोशिकाओं के जीवित रहने के लिए अपनी संभव महत्व का सुझाव दे, इसके अलावा, टेलोमिरेज oxidative तनाव से माइटोकॉन्ड्रिया की रक्षा करता है और apoptosis के लिए प्रतिरोध प्रदान करता है. हम पहले से विभिन्न माउस मस्तिष्क क्षेत्रों में टेलोमिरेज गतिविधि और अभिव्यक्ति को बढ़ाने के लिए और oxidative तनाव से मोटर न्यूरॉन्स की कोशिकाओं की रक्षा के लिए उपन्यास टेलोमिरेज activators की क्षमता का प्रदर्शन किया. इन परिणामों टेलोमिरेज विभिन्न घावों से न्यूरॉन्स की सुरक्षा में शामिल है कि धारणा को मजबूत. मस्तिष्क में टेलोमिरेज की भूमिका को रेखांकित करने के लिए, हम यहाँ पुरुष और महिला माउस मस्तिष्क में टेलोमिरेज की गतिविधि और उम्र पर अपनी निर्भरता की तुलना करें. ट्रैप परख विभिन्न ऊतकों या सेल लाइनों में टेलोमिरेज गतिविधि का पता लगाने के लिए एक मानक तरीका है. यहाँ हम analy का प्रदर्शनCHAPS का उपयोग प्रोटीन निकासी गैर denaturing द्वारा माउस मस्तिष्क के तीन क्षेत्रों में टेलोमिरेज गतिविधि की बहन मानक ट्रैप परख के संशोधन द्वारा बफर पीछा lysis.
इस 2 कदम परख में, अंतर्जात टेलोमिरेज TTAGGG 6 बी.पी. दोहराता (टेलोमिरेज प्रतिक्रिया) जोड़कर एक विशिष्ट टेलोमिरेज सब्सट्रेट (टीएस प्राइमर) elongates. टेलोमिरेज प्रतिक्रिया उत्पादों 6 बी.पी. वेतन वृद्धि का एक डीएनए सीढ़ी बनाने पीसीआर प्रतिक्रिया से परिलक्षित कर रहे हैं. डीएनए सीढ़ी का विश्लेषण बेहद संवेदनशील न्यूक्लिक एसिड दाग के साथ धुंधला हो जाना द्वारा पीछा 4.5% उच्च संकल्प agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा किया जाता है.
32 पी डीएनए का पता लगाने और डीएनए सीढ़ी को हल करने के लिए polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन के लिए रेडियोधर्मी dCTP के लेबल का उपयोग कि पारंपरिक ट्रैप परख की तुलना में, इस प्रोटोकॉल, माउस मस्तिष्क में टेलोमिरेज गतिविधि का मूल्यांकन करने की क्षमता के प्रदर्शन के लिए जाल परख बचत एक गैर विषैले समय प्रदान करता है telomeras में अंतर का पता लगानेविभिन्न महिला और पुरुष माउस मस्तिष्क क्षेत्र में ई गतिविधि.
Introduction
टेलोमिरेज टेलोमिरेज से बना एक Ribonucleoprotein रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस (TERT), टेलोमिरेज के उत्प्रेरक सबयूनिट, और एक शाही सेना घटक (TERC) है. टेलोमिरेज की विहित भूमिका इसलिए जीनोमिक अखंडता, और सेल प्रसार 1 को बढ़ावा देने, telomeric छोर तक दोहराए दृश्यों (TTAGGG) जोड़कर telomeres की उचित लंबाई की रक्षा के लिए है. यह विभिन्न हानिकारक एजेंट 2 द्वारा प्रेरित apoptosis के लिए प्रतिरोध प्रदान यानी अतिरिक्त भूमिकाओं, कोशिकाओं में TERT के लिए जिम्मेदार ठहराया गया, oxidative तनाव 3 से मानव mesenchymal स्टेम कोशिकाओं की रक्षा करता है, और सकारात्मक आरएनए TIA1 को अपने सहयोग से पूरी तरह से विभेदित न्यूरॉन्स में एक समर्थक अस्तित्व भूमिका निभाता कणिकाओं 4.
एंजाइम अभिव्यक्ति और गतिविधि के स्तर कसकर गैर विभाजित कोशिकाओं 5,6 में विनियमित रहे हैं, जबकि TERT, व्यक्त और मुख्य रूप से दैहिक कोशिकाओं को विभाजित में और कैंसर के सबसे प्रकार में सक्रिय है. अध्ययन अनुसंधान में पता चला है किTERT mRNA वयस्कता 7 में निचले स्तर पर बनाए रखा है, जबकि odent मस्तिष्क, टेलोमिरेज गतिविधि, प्रसव के बाद 10 दिन से undetectable हो जाता है. अन्य अध्ययनों वयस्क उप निलय क्षेत्र, घ्राण बल्ब, हिप्पोकैम्पस के भीतर टेलोमिरेज गतिविधि का प्रदर्शन किया, और वयस्क सेरिबैलम और प्रांतस्था 8 में. , इंजेक्शन चूहों SOD1 ट्रांसजेनिक में amyotrophic पार्श्व काठिन्य रोग की शुरुआत और प्रगति में देरी – हमने हाल ही में मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी डोरियों में टेलोमिरेज अभिव्यक्ति और गतिविधि बढ़ा कि उपन्यास यौगिकों एन मिथाइल-D-aspartate (NMDA) में न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव exerted कि प्रदर्शन चूहों और इन चूहों 9 की रीढ़ की हड्डी में मोटर न्यूरॉन्स के अस्तित्व में वृद्धि हुई. पूरी तरह से न्यूरॉन्स में और मस्तिष्क में टेलोमिरेज के समर्थक अस्तित्व भूमिका को समझते हैं, यह मस्तिष्क के विभिन्न क्षेत्रों में टेलोमिरेज गतिविधि का पता लगाने के लिए एक सरल और अपेक्षाकृत संवेदनशील तेजी से परख विकसित करने के लिए आवश्यक है.
telomeric REPEAT प्रवर्धन प्रोटोकॉल (ट्रैप) टेलोमिरेज की विहित गतिविधि और पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) के संयोजन एक प्रसिद्ध संवेदनशील परख है. इस परख में, टेलोमिरेज TTAGGG एक टेलोमिरेज सब्सट्रेट करने के लिए टीएस रिवर्स प्राइमर का उपयोग 6 बेस जोड़े (बीपी) डीएनए सीढ़ी उत्पन्न करता है जो पीसीआर प्रवर्धन द्वारा पीछा (टीएस प्राइमर) oligonucleotide, दोहराता कहते हैं -. ACX 32 पी लेबल dCTP का पता लगाने के लिए उपयोग किया जाता है पीसीआर उत्पादों की कम राशि. डीएनए सीढ़ी अनुक्रमण polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन (पेज) द्वारा हल हो गई है. दोनों डीएनए बैंड की तीव्रता और डीएनए सीढ़ी की लंबाई सक्रिय एंजाइम अणुओं की राशि और उनके processivity क्रमशः 10 दर्शाते हैं.
इस पारंपरिक परख कुछ बड़ी कठिनाइयों रखती है: (रात भर दोनों ही मामलों में) अनुक्रमण पृष्ठ और जेल चलाने का समय खपत और रेडियोधर्मी उत्पाद की फिल्म जोखिम को संभालने के लिए बड़ी और कठिन रेडियोधर्मी पदार्थों के लिए जोखिम के खतरे. </p>
इस प्रोटोकॉल एक बेहतर गैर रेडियोधर्मी agarose मिनी जेल आधारित परख प्रदान करता है. डीएनए 6 बीपी सीढ़ी 4.5% उच्च संकल्प agarose जेल का उपयोग कर हल हो गई है और पहचान अत्यधिक संवेदनशील न्यूक्लिक एसिड दाग का उपयोग कर हासिल की है. agarose उच्च संकल्प मिनी जेल और संवेदनशील न्यूक्लिक एसिड दाग का उपयोग करने का संयोजन, परख संभाल करने के लिए आसान प्रदान करता है रेडियोधर्मिता से संपर्क का खतरा समाप्त और काफी कई घंटे के लिए 3 दिनों से समग्र परख अवधि को कम.
Protocol
Representative Results
Discussion
पीसीआर 4 द्वारा टेलोमिरेज प्रतिक्रिया 3) टेलोमिरेज प्रतिक्रिया उत्पादों के प्रवर्धन – मस्तिष्क ऊतक 2) के विशिष्ट क्षेत्रों से 1) प्रोटीन निकासी टेलोमिरेज द्वारा प्राइमर बढ़ाव TS: जाल परख के माध्यम से माउ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was partially supported by B.G. Negev technology and Linda Powers’s contribution.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| TRAP Mix (X10) | Made manually, mix the following in UPW: 630mM KCl, 200mM Tris-HCl pH8.2, 10mM EDTA, 15mM MgCl2, 1mg/ml BSA, 0.5% TWEEN (purchased from sigma). Aliquots are freezed in -20 C. | ||
| Ringer's solution | Made manually, mix the following in DDW: 124mM NaCl, 3mM KCl, 1.25mM NaH2PO4*H2O, 2mM MgSO4, 26mM NaHCO3, 1.802 g/L D-(+)-glucose anhydrous. | ||
| Isoflurane | Minrad INC. | NDC 60307-110-10 | Handle with care in a chemical hood |
| dNTP's 10 mM | Sigma | D7295 | |
| TS primer (5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| ACX primer (5'-GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| Titanium Taq Polymerase/Buffer | Clontech | S1792/S1793 | |
| High Resolution agarose | Sigma | A4718 | Any high quality high-resolution agarose may be sutible |
| Mini-gel apparatus | Bio-Rad | 170-4466 | |
| Nucleic-acid Stain (GEL-RED) | Biotium | 41003 | |
| IC primer (5'-ATCGCTTCTCGGCCTTTT-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| CHAPS lysis buffer | Cell Signaling Technology | 9852S | Add PMSF (protease inhibitor) to a final concentration of 1mM |
| Ultra Pure Water (UPW) | Biological Industries | 01-866-1B | |
| CD-1 mice | HARLAN Laboratories INC. |
References
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