Telomerase aktivitet i de ulike regionene i Mouse Brain: ikke-radioaktive Telomerase Gjenta Amplification Protocol (TRAP) Assay
Summary
Telomerase is expressed in the neonatal brain and also in distinct regions of the adult brain. We present a non-toxic time saving TRAP assay for the analysis of telomerase activity in various regions of the mouse brain and detection of differences in telomerase activity between male and female mouse brains.
Abstract
Telomerase, et ribonucleoprotein, er ansvarlig for å holde telomere lengde og derfor fremme genomisk integritet, spredning og levetid. I tillegg beskytter telomerase mitokondriene fra oksidativt stress og resistens mot apoptose, noe som tyder på en mulig betydning for den gjenlevende av ikke-mitotisk, sterkt aktive celler så som nevroner. Vi har tidligere demonstrert evnen av nye telomerase-aktivatorer for å øke telomeraseaktivitet og ekspresjon i de forskjellige musehjerneregioner og for å beskytte motoriske nevroner celler fra oksidativt stress. Disse resultatene styrker den oppfatningen at telomerase er involvert i beskyttelse av nerveceller fra ulike lesjoner. For å understreke rollen til telomerase i hjernen, har vi her sammenligne aktiviteten av telomerase i mannlige og kvinnelige musehjerne, og dens avhengighet av alder. TRAP-analysen er en standard metode for påvisning av telomerase-aktivitet i forskjellige vev eller cellelinjer. Her demonstrerer vi analysis av telomerase-aktivitet i tre regioner av musehjerne ved ikke-denaturerende protein ekstraksjon ved hjelp av CHAPS lysis buffer etterfulgt av modifikasjon av standard TRAP-testen.
I denne to-trinns analysen, elongates endogen telomerase en bestemt telomerase substrat (TS primer) ved å legge TTAGGG 6 bp repetisjoner (telomerase reaksjon). De telomerase reaksjonsprodukter blir amplifisert ved PCR reaksjon skape en DNA-stige 6 bp trinn. Analyse av DNA-stigen er laget med 4,5% høy oppløsning agarose gelelektroforese etterfulgt av farging med meget følsom nukleinsyre flekken.
Sammenlignet med tradisjonelle TRAP-assay som bruker 32 P-merket radioaktivt dCTP står for DNA gjenkjenning og polyakrylamidgel-elektroforese for å løse DNA stige, denne protokollen gir en ikke-toksisk tidsbesparelse TRAP assay for vurdering av telomerase-aktivitet i musehjerne, som viser evnen til å oppdage forskjeller i telomerase aktivitet i de ulike kvinnelige og mannlige mus hjernen regionen.
Introduction
Telomerase er et ribonucleoprotein sammensatt av telomerase revers transkriptase (TERT), den katalytiske subenhet av telomerase og en RNA komponent (TERC). Den kanoniske rolle telomerase er å bevare den riktige lengde av telomerer ved tilsetning av repetitive sekvenser (TTAGGG) til de telomeric ender, således fremme genomisk integritet, og celleproliferasjon 1. Andre roller ble tilskrevet TERT i celler, dvs. den resistens mot apoptose indusert av ulike ødeleggende middel 2, beskytter menneske mesenchymale stamceller fra oksidativt stress 3, og spiller en pro-overlevelse rolle i fullt differensierte nevroner ved sin tilknytning til TIA1 positiv RNA granulater 4.
TERT uttrykkes og aktiv hovedsakelig i somatiske delende celler og i de fleste typer kreft, mens enzymet ekspresjon og aktivitet er strengt regulert i ikke-delende celler 5,6. Studier har vist at i rodent hjernen, blir telomerase aktivitet oppdages av postnatal dag 10, mens TERT mRNA er opprettholdt på lavere nivåer i voksen alder 7. Andre studier viste telomerase aktivitet i voksen sub-ventrikkel-sonen, luktelappen, hippocampus, og i voksen lillehjernen og cortex åtte. Vi har nylig vist at nye forbindelser som øker telomerase ekspresjon og aktivitet i hjernen og ryggmargen som utøves nevrobeskyttende effekter i N-metyl-D-aspartat (NMDA) – injiseres musene, forsinket inntreden og utvikling av amyotrofisk lateral sklerose sykdom hos SOD1 transgen mus og økt overlevelse av motoriske nerveceller i ryggmargen av disse musene ni. For fullt ut å forstå pro-overlevelse rolle telomerase i nerveceller og i hjernen, er det viktig å utvikle en enkel og forholdsvis følsomme hurtig analyse for deteksjon av telomerase-aktivitet i de forskjellige regioner av hjernen.
Den telomeric rEPEAT amplifikasjonsprotokoll (TRAP) er et velkjent sensitiv analyse som kombinerer den kanoniske aktivitet av telomerase og polymerase kjedereaksjon (PCR). I denne analysen, gir telomerase TTAGGG repeterer til en telomerase substrat (TS primer) oligonukleotid, etterfulgt av PCR-amplifikasjon som genererer 6 basepar (bp) DNA-stige ved hjelp av TS revers primer -. ACX 32 P-merket dCTP s brukes til å detektere lav mengde av PCR produktene. DNA stigen er løst ved sekvense polyakrylamidgelelektroforese (PAGE). Både intensiteten av DNA-båndene, og lengden av DNA-ladder gjenspeile mengden av aktive enzymmolekyler og deres processivity henholdsvis 10..
Denne tradisjonelle assay har noen store vanskeligheter: Faren for eksponering for radioaktive stoffer, store og vanskelige å håndtere sekvense PAGE og tidsforbruk av gelen løpe og filmeksponering av det radioaktive produktet (over natten i begge tilfeller). </p>
Denne protokollen gir en mer ikke-radioaktivt agarose mini-gel basert analysen. DNA 6 bp stigen er løst ved hjelp av 4,5% høyoppløselig agarosegel og påvisning oppnås ved hjelp av svært følsomme nukleinsyre flekken. Kombinasjonen av høy oppløsning ved hjelp av agarose mini-gel og følsom nukleinsyre flekken har lett å håndtere assay, eliminerer faren for eksponering for radioaktivitet og signifikant forkorte den totale analyse varighet fra 3 dager til flere timer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Analyse av telomerase-aktivitet i musehjerne via TRAP-analysen består av fire hovedtrinn: 1) ekstraksjon fra proteiner spesifikke regioner av hjernevev 2) TS primer forlengelse av telomerase – telomerase reaksjon 3) forsterkning av telomerase reaksjonsprodukter ved PCR 4 ) separering av PCR-produkter med høy oppløsning agarosegel.
Denne modifiserte analysen TRAP adresserer to store problemer som reiser seg fra den tradisjonelle assay: bruk av radioaktive dCTP største for sensitiv påvisn…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was partially supported by B.G. Negev technology and Linda Powers’s contribution.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| TRAP Mix (X10) | Made manually, mix the following in UPW: 630mM KCl, 200mM Tris-HCl pH8.2, 10mM EDTA, 15mM MgCl2, 1mg/ml BSA, 0.5% TWEEN (purchased from sigma). Aliquots are freezed in -20 C. | ||
| Ringer's solution | Made manually, mix the following in DDW: 124mM NaCl, 3mM KCl, 1.25mM NaH2PO4*H2O, 2mM MgSO4, 26mM NaHCO3, 1.802 g/L D-(+)-glucose anhydrous. | ||
| Isoflurane | Minrad INC. | NDC 60307-110-10 | Handle with care in a chemical hood |
| dNTP's 10 mM | Sigma | D7295 | |
| TS primer (5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| ACX primer (5'-GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| Titanium Taq Polymerase/Buffer | Clontech | S1792/S1793 | |
| High Resolution agarose | Sigma | A4718 | Any high quality high-resolution agarose may be sutible |
| Mini-gel apparatus | Bio-Rad | 170-4466 | |
| Nucleic-acid Stain (GEL-RED) | Biotium | 41003 | |
| IC primer (5'-ATCGCTTCTCGGCCTTTT-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| CHAPS lysis buffer | Cell Signaling Technology | 9852S | Add PMSF (protease inhibitor) to a final concentration of 1mM |
| Ultra Pure Water (UPW) | Biological Industries | 01-866-1B | |
| CD-1 mice | HARLAN Laboratories INC. |
References
- Urquidi, V., Tarin, D., Goodison, S. Role of telomerase in cell senescence and oncogenesis. Annu Rev Med. 51, 65-79 (2000).
- Cong, Y., Shay, J. W. Actions of human telomerase beyond telomeres. Cell Res. 18, 725-732 (2008).
- Tichon, A., et al. Oxidative stress protection by novel telomerase activators in mesenchymal stem cells derived from healthy and diseased individuals. Curr.Mol. Med. 13, 1010-1022 (2013).
- Lannilli, F., Zalfa, F., Gartner, A., Bagni, C., Dotti, C. G. Cytoplasmic TERT associates to RNA granules in fully mature neurons: Role in the translational control of the cell cycle inhibitor p15INK4B. PloS one. 8, e66602 (2013).
- De Jesus, B. B., Blasco, M. A. Potential of telomerase activation in extending health span and logevity. Curr opinion in Cell Biology. 24, 1-5 (2012).
- Blackburn, E., Collins, K. Telomerase: An RNP enzyme synthesizes DNA. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, 1-9 (2011).
- Klapper, W., Shin, T., Mattson, M. P. Differential regulation of telomerase activity and TERT expression during brain development in mice. J. Neurosci. Res. 64, 252-260 (2001).
- Caporaso, G. L., Lim, D. A., Alvarez-Buylla, A., Chao, M. Telomerase activity in the subventricular zone of adult mice. Mol. Cell Neurosci. 23, 693-702 (2003).
- Eitan, E., et al. Novel Telomerase-increasing compound in mouse brain delays the onset of amyotrophic lateral sclerosis. EMBO Mol. Med. 4, 313-329 (2012).
- Kim, N. W., Wu, F. Advances in quantification and characterization of telomerase activity by the telomeric repat amplification protocol (TRAP). Nuc. Acid Res. 25, 2595-2597 (1997).
