This protocol describes the dissection and cultivation of intact testes and germ-line cysts from Drosophila melanogaster pupae. This method allows microscopic observation of spermatogenesis ex vivo. Furthermore, we describe a pharmacological assay of the effect of inhibitors on specific stages of germ-cell development in pupal testes.
Under spermatogenese hos pattedyr og i Drosophila melanogaster udvikle mandlige kimceller i en række væsentlige udviklingsmæssige processer. Dette omfatter differentiering fra en stamcelle befolkning, mitotisk forstærkning, og meiose. Desuden, efter meiotiske kimceller undergår en dramatisk morfologisk omformning proces samt en global epigenetisk omkonfigurering af kønsceller kromatin-histon-til-protamin afbryder.
Studere den rolle, et protein i post-meiotisk spermatogenese hjælp mutagenese eller andre genetiske værktøjer er ofte hæmmet af væsentlig embryonale, præ-meiotisk eller meiotiske funktioner i proteinet under undersøgelsen. Den post-meiotisk fænotype af en mutant af et sådant protein kan skjules ved hjælp af en tidligere udviklingsmæssige blok eller fortolkningen af fænotypen kan være kompliceret. Modellen organisme Drosophila melanogaster tilbyder en omfartsvej til dette problem: intakte testikler ogendda cyster af kønsceller dissekeret fra tidlig pupper er i stand til at udvikle ex vivo i dyrkningsmedium. Udnyttelse af sådanne kulturer tillader mikroskopisk billeddannelse af levende kønsceller i testiklerne og kim-line cyster. Vigtigere er det, de dyrkede testiklerne og kimceller også bliver tilgængelige for farmakologiske hæmmere, hvilket tillader manipulation af enzymatiske funktioner under spermatogenesen, herunder post-meiotiske stadier.
Protokollen forelægges beskriver, hvordan man dissekere og dyrke puppe testikler og kim-line cyster. Oplysninger om udvikling af puppe testikler og dyrkningsbetingelser leveres sammen med mikroskop billeddata af levende testikler og kim-line cyster i kultur. Vi beskriver også en farmakologisk assay at undersøge post-meiotisk spermatogenese, eksemplificeret ved et assay målrettet histon-til-protamin afbryder hjælp af histonacetyltransferase inhibitoren anacardic syre. I princippet kunne denne dyrkningsmetode tilpasses for at imødekomme mange other forskningsspørgsmål i præ-og post-meiotisk spermatogenesen.
Udviklingen af mandlige kimceller mange arter er en sekventiel proces. Det er kendetegnet ved en række afgørende begivenheder, der kulminerer i dannelsen af morfologisk og epigenetisk højt specialiserede spermatozoer. I Drosophila melanogaster, kim-line stamceller på spidsen af testiklerne kløft asymmetrisk at give anledning til en ny stamcelle og spermatogonium, dvs datter celle, der er forpligtet til at differentiering (se figur 1 for en oversigt) 1,2 . Den spermatogonium gennemgår fire runder af mitotiske divisioner, og med debut af meiose, en fase med en imponerende vækst og transskriptionsaktivitet kaldes spermatocyte scenen. Cellerne stammer fra en spermatogonium forblive forbundet til hinanden og udvikle sig som en synkroniseret bundt indpakket to somatiske celler-en struktur, der er nævnt som en cyste. Efter afslutning af meiose, morfologi af de mandlige kimceller er heltomstruktureret (vist skematisk i figur 1). Indledningsvis runde spermatider langstrakte for at danne den hydrodynamiske hovedkonstruktion og flagel udvikler sig. Til sidst er de sædceller adskilt fra hinanden af et komplekst, apoptose-relaterede mekanisme kaldet individualisering 3 – 5.
I mange arter, herunder Drosophila melanogaster og pattedyrarter, de morfologiske ændringer af kønsceller er ledsaget af en bemærkelsesværdig epigenetisk omlægning af det haploide mandlige kim-line kromatin, kaldet histon-til-protamin afbryder (HP switch) 6. – 9.. Eventuelt næsten alle kanoniske histon og mange histon-variantmolekyler strippet fra DNA og erstattes af små grundlæggende proteiner, protaminerne, hvilket resulterer i meget kompakt nucleoprotamine struktur specifikke kromatin modne sædceller. Generelle egenskaber af HP-kontakten er than udskiftning af kanoniske histoner først ved histon varianter, derefter ved overgangs- proteiner, og endelig af protaminer. Alt dette er ledsaget af flere ændringer i epigenetiske mærker, såsom en stigning i acetyleringsniveauer af histon H4 lige før histon fjernelse 7,10 – 12.
De fleste, hvis ikke alle, af de ovenfor nævnte processer er afgørende for udviklingen af modne, fuldt fertile sperm. Dette gælder ikke kun i Drosophila, men også i mennesker, som pattedyr spermatogenese deler en betydelig mængde af lighed med det hvirvelløse systemet 1,8,9. Studere mandlig udvikling kim-celle lettes i høj grad i Drosophila modelsystem. Fluer er genetisk meget tilgængelig. Frembringelsen af mutanter samt etablering af flyve-stammer, der udtrykker fusion gener eller RNA-interferens konstruktioner tager lidt indsats. Men i studiet af post-meiotisk spermatogenese anvendelse af mutanter end simple genetiske værktøjer kan nå en grænse. I Drosophila spermatogenesen, transskription ophører næsten helt med indrejse i meiotiske divisioner. Således er post-meiotisk spermatogenese hovedsagelig baseret på translatorisk undertrykt og gemt mRNA syntetiseret i en udvidet meiotiske profase 13-16. Derfor værktøjer som RNA-interferens eller brug af ikke-betingede mutanter er ikke egnet til at studere specielt post-meiotiske roller genprodukter, der også opfylder væsentlige funktioner i præ-meiotiske eller meiotisk udvikling kim celle.
En fordel ved Drosophila, der kan udnyttes i sådanne tilfælde er muligheden for dissekerede intakte testikler og endda cyster i kimceller at udvikle ex vivo i dyrkningsmedium 4,12,17 – 20. Dissektion og dyrkning af testikler eller kim-line cyster ikke kun tillader mikroskopisk observation af kim-celle udvikling i levende celler, men enLSO brugen af farmakologiske assays med f.eks hæmmere af enzym-komplekser, såsom histon acetyltransferaser (HATS), HDACi (HDAC), topoisomeraser eller proteasomet. Således er det muligt at manipulere enzymatiske funktioner under post-meiotisk spermatogenese og overvåge de udviklingsmæssige udfald uanset embryonale, præ-meiotiske eller meiotiske funktioner 4,12.
I farmakologiske assays vi tidligere analyserede acetyleringen-afhængige lokalisering af en bromodomain proteinet under meiotisk profase samt relevansen af histonacetylering niveauer for epigenetiske HP-kontakten i post-meiotisk spermatogenese ved hjælp af specifikke inhibitorer rettet Hatte og HDAC'er 12,21. Målretning af HP-kontakten i disse analyser blev muliggjort ved hjælp af en flue stamme, der udtrykker fusion generne histone2AvD-RFP og protamineB-eGFP 12,22 i de endogene mønstre, og den iagttagelse, atde første spermatider i puppe testikler passere gennem HP skifte mellem 24 og 48 timer APF 12.
Protokollen præsenteres beskriver dissektion af testikler og cyster fra Drosophila pupper, dyrkningsbetingelserne, og en farmakologisk assay med intakte puppe testikler. Til dette formål er puppe testikler ved omkring 24 timer efter puparium dannelse (APF) dissekeret (se figur 1 og 2). På dette tidspunkt har testiklerne ikke foretaget tilslutninger til andre væv og er omgivet af en tynd ydre kappe, som giver bedre indtrængning af inhibitorforbindelser 23,24. Testiklerne er bean- eller pæreformet organer, der let kan tages i kulturen. Disse testiklerne dissekeres, dyrket og behandlet med specifikke inhibitorer. Efterfølgende virkningerne af inhibitorer overvåges ved hjælp af immunofluorescens-analyser og fluorescensmikroskopi fusionsprotein udtryk, og ved sammenligning af den nukleare morpholnologi af de behandlede kimceller med ubehandlet kønsceller. De betingelser, der præsenteres i denne protokol tillader også levende billeddannelse udvikle testikler og kim-line cyster i kultur.
Den præsenterede protokol beskriver to forskellige applikationer baseret både på evnen til at dissekere Drosophila testikler og enkelt kim-line cyster på et givet udviklingstrin og i ex vivo-udviklingen af disse celler og væv i en dyrkningsskål. En ansøgning er den farmakologiske manipulation af vitale processer i løbet af sæd udvikling. Vigtigere er det, dette giver adgang til post-meiotisk spermatogenese, der ikke nemt opnået ved hjælp af funktionelle analyser baseret på flyve genetik. Den anden anvendelse er mikroskopisk observation af levende og udvikle kønsceller og testikler. Især denne ansøgning fordele fra evnen af Drosophila-celler og organer i kultur til at overleve og udvikle sig ved stuetemperatur og under normale atmosfære. Derfor et inverteret billeddannelse mikroskop udstyret med et opvarmet fase (opvarmning til standard avl temperatur på 25 ° C) er tilstrækkelig til at opnå meningsfulde resultater i levende billeddannelse eksperimenter. Yderligeremere, mange transgene flyve stammer, der udtrykker fluorescerende protein-mærkede proteiner til direkte billedvisning eksisterer eller kan let etableres.
For at opnå puppe testikler eller kim-line cyster af en bestemt udviklingsstadiet, er det afgørende, at man er fortrolig med timingen af Drosophila udvikling. Den præcise timing for hver fase kan variere blandt laboratorier, dyrkningsbetingelser og flyve stammer og skal etableres empirisk. Som beskrevet ovenfor, er det især vigtigt for farmakologiske assays, for eksempel rettet mod HP switch. For sådanne eksperimenter, er det tilrådeligt at altid tjekke for spermatider med en ProtamineB-eGFP signal, før den egentlige inhibitor test, fordi timingen kan variere lidt selv inden for et befolkning.
Efter protokollen ovenfor, bør gøre det muligt forsøgslederen at dissekere testikler fra tidlige puppe stadier som intakte organer fri for vedlagte fedt kropsvæv. Disse testikler og, i endnu højere grad, isoleret geRM-line cyster er meget skrøbelige. Derfor er det afgørende at udvikle håndelag og erfaring er nødvendig for at håndtere og overføre testikler og cyster ved hjælp af pincet, kanyler og pipetter. Især undersøgelser rettet meiotisk og tidlig udvikling post-meiotisk kim-celle ville drage fordel af dette. Selv om det er forholdsvis let at dissekere cyster sene spermatider med lang flageller fra voksne testikler, er det vanskeligt at opnå tidligere stadier. Dissekere disse cyster fra tidlige puppe testikler efter denne protokol er meget mere effektiv. Husk på, at i en sædvanlig flue stamme, vil kun ca 50% af pupper være mand. Derfor klar til at dissekere mindst dobbelt så mange pupper som antallet af testikler påkrævet. Alternativt er det muligt at identificere mandlige L3 larver hjælp af et stereo-mikroskop, da testiklerne kan identificeres som gennemskinnelige runde organer indlejret i de laterale fedt kropsvæv i den intakte larve 23,34, og at samle dem i friske kultur hætteglas, kanbruges til at vælge præ-pupper for iscenesættelse og dissektioner. Det er også muligt at identificere mandlige pre-pupper 35.
Vi bemærkede, at både de isolerede kim-line cyster og de intakte puppe testikler i kultur er følsomme over for lys, som er også blevet rapporteret tidligere 18. Denne lysfølsomhed kan også holde til nogle kemiske forbindelser, der anvendes i farmakologiske assays. Derfor er det bedst at holde dyrkningsskålene af et assay i mørke under inkubation. Ligeledes, når planlægningen af time-lapse imaging eksperimenter med udviklingslande testikler og især isolerede cyster, huske på, at alt for lange eksponeringstider og / eller for høj målehastigheder kan hæmme ex vivo udvikling. Den passende samplingfrekvens skal bestemmes ved forsøg.
Bakteriel og / eller svampeinfektion og over-vækst i dyrkningsskålene udgør et alvorligt problem. Inficerede kultur retter med alt for mange bakterier understøtter ikke ex vivo develing af testiklerne og cyster. Derfor beskrevne dyrkningsmedium indeholder penicillin og streptomycin (se trin 1.1), men under langvarig inkubation kan disse antibiotika blive nedbrudt og deres aktivitet måske aftage. Dette kunne være en af årsagerne til den begrænsede tid for overlevelse (max. 72 timer) af dyrkede cyster observeret ved brug af protokollen ovenfor. Alligevel denne tidsramme ikke kunne udvides ved løbende udskiftning af dyrkningsmediet i skålene. Vi konkluderer, at andre faktorer kan påvirke overlevelsen i kultur, såsom en manglende vækst signaler fra andre væv i kønsorganerne. På den anden side, post-meiotisk udvikling er hurtigere i Drosophila end i pattedyr. I Drosophila, spermiogenesis tager cirka 90 timer, og HP-kontakten finder sted mellem 50 og 60 timer efter meiose 9,12. Således sædvanlige overlevelsestid på omkring 48 timer opnået med denne protokol er velegnet til at følge centrale udviklingsprocesser in spermatogenesis, såsom meiotiske divisioner eller HP switch. Selv om bakteriel eller svampekontaminering kan undgås ved hjælp af rene værktøjer og medier, har fremlagt protokol ikke gøre brug af strengt sterile arbejdsforhold, fordi fluer og flyve testikler allerede indeholder bakterier, når rejst under standardbetingelser. Alligevel kan nogle anvendelser af denne kultur teknik gavn af fluer dissekeret eller endda rejst under aseptiske betingelser (protokoller, se 17,36,37).
Farmakologiske analyser afhænger af anvendelsen af kemiske forbindelser, der virker som inhibitorer eller aktivatorer af forskellige enzymer. Forbindelserne, der almindeligvis anvendes i sådanne forsøg afviger ofte meget i deres mål specificitet. Som en fordel, det giver mulighed for at målrette hele enzymklasser, for eksempel med anacardic syre hæmmende P300 / CBP PCAF og MYST familiemedlemmer HATS 38. Ulempen ved dette kunne være potentiel off-mål eller cytotoksiske virkninger INDUCed af sådanne forbindelser. Derfor bør hver anvendt i et assay med puppe testikler eller cyster forbindelse testes for dets cytotoksicitet og specifik virkning ved forskellige koncentrationer. Desuden kan små variationer i de dyrkningsbetingelser, Forbindelse Koncentration eller aktivitet, og variationer i cellepermeabilitet føre til variation af de inducerede virkninger. Derfor er det nødvendigt at overvåge behandlingens succes i hvert forsøg. For eksempel, når vi anvendte anacardic syre ved 150 uM, observerede vi lille variation i styrken af chromatinkondensering fænotype mellem og undertiden i nogle testikler, mens acetylering af histon H4 konsekvent faldt.
Farmakologiske assays med Drosophila testikler i kultur er blevet anvendt til at analysere før og efter meiotiske mekanismer spermatogenesen 4,12,14,21. Da det er vanskeligt at få adgang post-meiotisk spermatogenese med genetiske værktøjer til at målrette spillere med essential præ-meiotiske og meiotiske funktioner, udgør et alternativ denne ex vivo fremgangsmåde. Desuden principielt metoden kan tilpasses til puls-chase-eksperimenter for at følge udviklingen af behandlede kønsceller over tid. Vi har imidlertid endnu ikke undersøgt denne mulighed. Gør brug af tidlig puppe testiklerne er en fordel i farmakologiske assays. For det første kan den tynde ydre kappe af de unge puppe testikler (ca. 24 timer APF) muliggøre forbedret permeabilitet af kemiske forbindelser. For det andet, når man studerer den post-meiotisk HP switch, de puppe testikler dissekeret på 24 timers APF fra Protamine-GFP-udtrykkende fluelinen muliggøre en direkte udlæsning af, hvorvidt HP kontakten blev påvirket eller ej.
Til dato har flere protokoller for ex vivo dyrkning af Drosophila organer og væv, herunder testikler og kim-line cyster blevet udviklet (se fx 4,14,17,20,39,40). Dyrkningsmediet, og de generelle betingelser, der anvendesi protokollen præsenteres her blev etableret i 1979 17. Kulturen system blev senere tilpasset til in vivo billeddannelse af individualisering mekanisme sene post-meiotiske cyster isoleret fra voksne testikler 4. Tidligere har vi rapporteret, at disse betingelser understøtter også overlevelse og differentiering af meiotisk og tidlige post-meiotiske kønsceller i deres cyster for omkring 48 timer 12. I modsætning til andre dyrkningssystemer 19 den observerede udviklingsmæssige timing i disse kulturer var omtrent overens med timingen bestemmes ud fra faste prøver (for detaljer, se 12). H2AvD-RFP og Protamin-GFP-fluorescens-signaler kan anvendes til at visualisere den nukleare morfologi og kromatin sammensætning af kimceller i kultur. Vi fandt, at for en klar identifikation af udviklingsstadier i kultur, det er fordelagtigt i forhold til andre kriterier, såsom coiling af cyster. Vigtigere, har fremlagt protokol ikke indebærer tilsætning af flyve extRACT eller andre grunde end kalvefosterserum vækstfaktorer. Desuden viser vi her, at de betingelser er forenelige med fluorescens mikroskopi billeddannelse af meiotiske divisioner ex vivo i kultur. Billeder kan opnås med en rimelig opløsning i en nem-at-bruge medium, der understøtter en langsigtet udvikling. Dette er i modsætning til protokoller gør det muligt på kort sigt (ca. 3 timer) observationer i Voltalef olie 41,42.
De ovenfor beskrevne til dyrkning og farmakologisk behandling af puppe testikler og enkelt mandlige kim-line cyster procedurer er let at tilpasse til de mange genetiske, epigenetiske, cellebiologiske, eller udviklingsmæssige spørgsmål, som kan forsket i Drosophila spermatogenesen. Dette omfatter især forskning med fokus på kim-line stamceller. Det er blevet påvist, at stamceller udvikling kan følges i levende billeddannelse af dyrkede voksne testikler 20,43. Men den peristaltiske bevægelse af det modne testis sheath forstyrrer billedet købet. Derfor er enten billedbehandling gjort ved hjælp af fragmenterede testikler 43 eller antallet af imaging eksperimenter udført skal øges for at tage højde for mistede datasæt 20. Tidlige puppe testikler (24 timers APF) er endnu ikke lukket med muskelceller. Selv lidt ældre testikler (36-45 timers APF) synes at vise nogle peristaltiske bevægelser (sammenlign figur 3 og supplerende video 1). Derfor dyrkning af unge puppe testikler som intakte organer kunne tjene som et alternativ.
Endvidere, når beherskes, evnen til at dissekere puppe testiklerne og i sidste ende isoleret cyster kimcelleudviklingen vil tillade yderligere ansøgninger bruger enkelte cyster som en kilde til en homogen, omend små, cellepopulationen. For eksempel er det således muligt at udføre RT-qPCR at analysere den transkriptionelle regulering af bestemte gener under definerede stadier af spermatogenese, som det allerede er blevet påvist <sup> 15.
The authors have nothing to disclose.
The authors wish to thank T. Noguchi for helpful advice on the initial establishment of the culture technique in our laboratory. Research in the lab of R. R.-P. was funded by the DFG within the international collaborative research center TRR81.
Anacardic acid | Merck Millipore | 172050 | brand: Calbiochem (EMD Millipore) |
Anti-acetyl-Histone H4 | Merck Millipore | 06-598 | brand: Upstate |
AxioCam MRm | Zeiss | ||
AxioObserver.Z1 inverted microscope | Zeiss | ||
Dimethyl sulfoxide | Sigma | D8418 | |
Dumont 5-Inox forceps | Dumont | multiple suppliers | |
Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Sigma | F4135 | |
Fiber optical illuminator | multiple suppliers | ||
Glass Bottom Microwell Dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
goat anti-rabbit IgG (H+L)-Cy5 | Dianova | 711-175-152 | |
Hoechst | Sigma | B1155 | |
Inoculation loop or pin holder | multiple suppliers | ||
Austerlitz INSECT PINS stainless steel needles, size 0 | Plano GmbH | N5018 | In our hands both these pin sizes worked well in the dissections. The minutiens are less rigid but have a smaller tip diameter. |
Austerlitz INSECT PINS stainless steel minutiens, diam. 0.1 mm | Plano GmbH | N5014 | |
Multiwell plates, 24-wells | Becton Dickinson | 351147 | brand: Falcon |
Pen Strep | invitrogen | 15070 | brand: Gibco |
Shields and Sang M3 Insect Medium | Sigma | S8398 | |
Stemi SV6 binocular | Zeiss |