Этот метод создает осязаемое, знакомую среду для мыши для навигации и изучения во микроскопических изображений или одноклеточных электрофизиологических записей, которые требуют твердой фиксации головы животного.
Широко признано, что использование общих анестетиков может подорвать актуальность электрофизиологических или микроскопических данных, полученных из мозга живого животного. Кроме того, длительный восстановление после анестезии ограничивает частоту повторных эпизодов записи / изображений в продольных исследованиях. Таким образом, новые методы, которые позволили бы стабильные записи с не-наркозом ведет себя мышей, как ожидается, для продвижения области клеточной и когнитивных нейронаук. Существующие решения варьируются от простого физического воздействия к более сложным подходов, таких как линейных, так и сферических беговые дорожки, используемых в сочетании с компьютерной генерируемые виртуальной реальности. Здесь, роман способ описан, где голова фиксируется мышь может передвигаться воздушным поднял мобильного homecage и исследовать его окружение под свободной от стрессов условиях. Этот метод позволяет исследователям выполнять поведенческие тесты (например, обучения, привыкания или распознавания новых объектов) одновременно сдвухфотонного микроскопические изображения и / или патч-зажим записи, все это объединено в одном эксперименте. Это видео-статья описывает использование в активный головой животного фиксации устройства (мобильного homecage), демонстрирует процедуры животного привыкания, и является примером ряд возможных применений метода.
Захватывающая последнее время тенденция в нейронаук является разработка экспериментальных подходов для молекулярной и клеточной зондирования нейронных сетей в мозгу проснуться, ведет себя грызунов. Такие подходы провести обещают пролить новый свет на нейрофизиологических процессов, лежащих в основе моторную функцию, интеграцию сенсомоторную, восприятие, обучение, память, а также прогрессирование травмы, нейродегенерацию и генетических заболеваний. Кроме того, записи из мозга бодрствует животного держит обещание в разработке новых терапевтических агентов и методов лечения.
Существует растущее понимание, что анестезия, которая была широко используется в нейрофизиологических экспериментах, может повлиять на основные механизмы работы мозга, что может привести к ошибочной интерпретации экспериментальных данных. Таким образом, широко используется обезболивающий кетамин быстро увеличивается образование новых дендритных шипиков и усиливает синаптическую функцию 1; другой обычно используемый anesthetМикросхема изофлюран при хирургических уровнях анестезии полностью подавляет спонтанную активность коры у новорожденных крыс и блоков шпинделя-всплесков колебаний в взрослых животных 2. В настоящее время только ограниченное количество подходов позволит эксперименты в не-наркозом мышей с помощью двухфотонного микроскопических изображений или патч-зажим записи. Эти подходы можно разделить на свободно движущихся и головы фиксированной препаратов.
Уникальная привлекательность свободно движущейся подготовки животных является то, что он позволяет оценить естественное поведение, в том числе целых движений тела во время навигации. Один из способов изображения внутри мозга свободно движущейся грызуна приложить миниатюрные устанавливаемый на головке микроскопа или Fiberscope 3-5. Тем не менее, миниатюрные устройства, как правило, имеют ограниченный оптические характеристики в сравнении с объективной основе двухфотонного микроскопии, и не может быть легко объединены с целыми клеток патч-зажим записи 6.
Exiжала решения для головы фиксации активный грызуна полагались в основном либо на физических ограничений 7,8 или на обучение животное выставлять добровольное подголовник 9. Другой популярный подход, чтобы позволить конечности животного двигаться, разместив его на, например, сферическую беговую дорожку 10; этот подход часто сочетается с генерируемой компьютером виртуальной реальности. Электрофизиологические эксперименты на мышах с черепно-фиксированный в основном используется внеклеточных записи и были использованы для изучения центральной регуляции сердечно-сосудистой системы 11, эффекты анестезии на нейронной активности 12, слуховой ответ в стволе головного мозга 13 и обработки информации 14. Пионерские внутриклеточные / записи цельноклеточные в активных ведет себя животных были проведены в 2000-х годах и были направлены на нервной деятельности, связанной с восприятием и движения 15-20. Примерно в то же время, первые микроскопические исследования изображений на бодрствующих мышей пабlished, где двухфотонного микроскопии в сенсорной коре физически сдерживали крыс 7 и на мышах, работающих на сферической беговой дорожке 21.
Последующие IN VIVO микроскопия и электрофизиологии исследования показали, что препарат глава фиксация можно успешно сочетать с поведенческими парадигм, основанных на движениях передних конечностей, распознавание запаха, взбивая, и облизывая 8,22-25. Мыши Расположенные сферической беговой дорожке можно научить ориентироваться в виртуальную визуальную среду сгенерированный компьютером 10,26. Внутриклеточные / внеклеточных записи показали, что в головном фиксированной животного ходовом такую виртуальную среду, активация гиппокампа место клеток могут быть обнаружены 27. В виртуальной визуальной среды, мыши демонстрируют нормальное движение связанных тета-ритма в местной потенциала поля и тета-фаз прецессии во время активного движения 27. В последнее время пространственная и временная Activitу модели нейронных популяций были записаны оптически мышей во время работы решения памяти задачи в виртуальной среде 28.
Несмотря на то, включен исследования прорыва, сферическая конструкция беговой дорожке имеет несколько ограничения, присущие. Во-первых, животное необходимо для перехода на неограниченное поверхности вращающегося воздуха поднял мяч, который не представляет никаких видимых препятствий, таких как стены или барьеры. Это ограничение только частично компенсируется генерируемой компьютером "виртуальной реальности", так как визуальный ввод, возможно, менее эффективны на мышах и крысах по сравнению с тактильной сенсорной информации (например, усов на ощупь или лизать), который, естественно, эти виды рассчитывать на. Во-вторых, значительное кривизна поверхности шара может быть неудобно для лабораторных мышей, используемых в ходьбе по ровной поверхности пола в своих клетках. Наконец, сам диаметр шара (по крайней мере, 200 мм для мышей и 300 мм для крыс) оказывает вертикальный размер сферическаяБеговая дорожка устройство относительно большим. Это делает его трудно сочетать сферическую беговую дорожку с большинством имеющихся в продаже микроскопии установок, и часто требует строительства новой установки вокруг беговой дорожке с помощью заказных кадров микроскопа.
Здесь, роман способ описан, где голова фиксируется мышь может двигаться вокруг мобильного homecage воздуха поднимается, который показывает ровный пол и ощутимые стены, а также изучить физическую среду под свободной от стрессов условиях. В этой статье показано процедуры подготовки мыши и головы фиксации, а также предоставляет характерные примеры, где двухфотонного микроскопия, внутренняя оптических изображений и патч-зажим записи выполняются в мозге бодрствующих ведет себя мышей.
Чтобы лучше понять физиологию мозга и патологии, исследования должны быть выполнены на различных уровнях сложности подготовки, используя наиболее подходящие методы для каждого препарата. В настоящее время широкий спектр нейронауки методологий (от всего тела МРТ в суб-органелл STED микроскопии) легко применены к наркозом животных, в то время как эксперименты по бодрствующих и ведущих себя животных представляет собой значительный методологический вызов.
Здесь новый подход описан где лабораторным животным, несмотря на то, твердо голова фиксируется, может передвигаться воздушным поднял мобильного homecage и исследовать его материальное окружение под свободной от стрессов условиях. Глава фиксированной себя подготовка животных представлены здесь предоставляет ряд важнейших преимуществ. Во-первых, электрофизиологические или изображений данные, полученные с помощью этого метода являются бескомпромиссной ни анестезии, ни затрудненность стрессу. Позиционирование мыши в доме на колесахклетка быстро и не требует анестезии животного даже временно. Во-вторых, воздух-поднял homecage обеспечивает механическую стабильность, необходимую для количественной оценки изменений в тонкой нейронов морфологии и записать электрофизиологические активность одноклеточных у бодрствующих животных. Наконец, конструкция мобильного homecage является более компактным по сравнению с сферической беговой дорожке, таким образом позволяя позиционирования мобильной homecage под стандартной прямой микроскоп для двухфотонного визуализации или записи патч-зажим в головном мозге бодрствующих мыши.
Фирма фиксация головы в мобильном homecage требуется имплантация специально разработанной четырехдверный металлический держатель, с круглым отверстием в центре для оптического или электрического доступа к основной области мозга. Эти держатели металлические прикреплены к черепу с помощью комбинации клея, зубным цементом и небольшой болт ввинчивается в кости черепа. Эта хирургическая процедура была разработана на основе большого числа ранееопубликованные процедуры, и было обнаружено, приводит к стабильной и воспроизводимой черепной подготовки окна. В естественных условиях электрофизиологических экспериментов, в форме полумесяца окна 34, малый размер трепанации черепа (менее 0,5 мм) 32 и просверленные застекленном подготовки 35 были использованы. Здесь «перевернутой буквы" черепной окно имплантировали либо с большим диаметром (3,5 мм) или небольшой (диаметром менее 0,5 мм) краниотомии. Минимизация движение мозга имеет решающее значение для стабильных записей отдельных клеток, и именно поэтому он рекомендуется выполнить небольшие краниотомии размера для электрофизиологических экспериментов. По имплантации черепной окна для экспериментов оптических изображений, животные дают восстановиться, по крайней мере 2 или 3 недели, в течение которых окно сначала временно теряет прозрачность, а затем восстанавливает его (с выходом 50-70%, в зависимости от генетический фон штамма мыши). Прозрачность черепной окна и Stabilность зубного цемента «шапкой», прикрепленной к черепу можно проверить с помощью регулярной бинокулярный микроскоп и физического досмотра во время обращения с животными. В конце на 2-3 недельного периода восстановления, те животные, которые показывают каких-либо признаков остаточной послеоперационного воспаления или механических дефектов в зубной цемент, должны быть исключены из экспериментов и прекращается.
Оптимальный возраст для начала обучения мышей в 2-4 месяца (в соответствии с массой тела 20-40 г). У молодых животных, закрепление зубной цемент "шапкой" к черепу могут быть ненадежными, которые могут уменьшить свою устойчивость к механическим нагрузкам, что налагается передвижения головного фиксированной мыши в мобильном homecage. Хотя мужчины и женщины мышей кажутся одинаково готовы ориентироваться в мобильном homecage, существует тенденция для достижения лучшего процент черепных окон восстановления их прозрачности у самок мышей (данные не представлены). Таким образом, для того, то обеспечить сбалансированное сочетание полов в когорте животных выбранных для работы с изображениями, имплантации черепные окна примерно на 30% больше самцов мышей рекомендуется. Социальные взаимодействия, как известно, улучшить благосостояние животных и уменьшить стресс, поэтому желательно, чтобы помета работают и обучаются параллельно и держались вместе в группу жилищных клетках.
В отличие от опубликованных процедур для сферического подготовки беговой дорожки 13, метод с использованием мобильного homecage не требует анестезии мыши в момент головной фиксации. Это различие важно, потому что это позволяет исключить любые остаточные явления, что даже краткий и "свет" анестезия эпизод, вероятно, от физиологических измерений, полученных вскоре после этого. В самом деле, несмотря на то, в исследованиях, где глава фиксация было сделано под наркозом и фактические эксперименты были начаты после краткого периода ожидания 13, нельзяисключить возможные долгосрочные последствия краткого анестезии эпизоде на экспериментальных данных. Другие исследования опирались на лишение воды для систематического привыкания животных к возглавляют фиксацию и используется награду воды как средства мотивации животное остаются неподвижными 36. Однако метод голова фиксация награда основе ограничивает выбор применимых поведенческих тестов и, что немаловажно, занимает одно из устоявшихся стимул-вознаграждение ассоциаций. В противоположность этому, метод мыши привыкания к голове фиксацию в мобильном homecage не требует водной депривации и последующее вознаграждение.
Дополняя мобильный homecage с системой подачи воды рекомендуется для длительных экспериментов. Учебные животных сессии и эксперименты, представленные здесь, были сделаны в дневное время (с 8 утра до 6 вечера), что соответствует физиологически пассивного периода для тех мышей, которые хранятся в соответствии со стандартной 12-часовой световой графика (Lights на в 6 утра и выключается в 6 часов вечера). Поскольку потребление воды напрямую связано с деятельностью мыши, во время пассивных мышей период не требуют подачу воды, если продолжительность сеанса обучения / изображения / записи не превышает 2 часов. В дополнение к времени и продолжительности тренировок, нужно решить вопрос об оптимальном количестве проведенных сеансов, необходимых для приучая животных на мобильный homecage. С этой целью два критерия были использованы для оценки стресс, вызванный процедур головы фиксации: Я) потеря веса, и II) уровне двигательной активности. Как показано на рисунке 6, потеря веса достигает среднего уровня 6% по обучению день 2, и полностью отменено учебного дня 4 (рис. 6А). Последовательно с весом динамики, уровень двигательной активности головных фиксированной животных подавляется в первый день обучения, но стабилизирует по тренировочного дня 4 (рис. 6D). На основе этих измерений, предложет, что минимальная длительность периода обучения мыши на мобильный homecage 4 дня, как описано в протоколе настоящим.
Использование воздушного поднял, плоский полом мобильного homecage позволяет добавлять сложные задачи (сенсомоторных, перцептивных и когнитивных) в учебные парадигм мышей головы фиксированной. В настоящем исследовании два протокола из поведенческих тестов представлены. Оба протокола использовать запах сигналы и могут быть объединены с продольными изображения / записи в коре головного мозга мыши. Хотя мобильная homecage изготовлен из непоглощающих материалов, один все еще необходимо принимать во внимание возможные помехи между запахом устройства и тест запаха (ы). Другим фактором, который может влиять на визуальных / тактильных сигналов поведенческого эксперимента является узлом между стеной и вставки, которая не является цельной и может, таким образом, быть воспринято животным в качестве ориентира. Стоит отметить, что здесь, для того чтобы свести к минимуму стресс животного в течение такого интеrventions как размещение запах-представляющих хлопка на мобильный homecage стене, экспериментатор должен практиковать для выполнения таких вмешательств как можно быстрее и избегать длительного обработку углеродного каркаса. Альтернативные стратегии нового представления запах / объекта мыслимы, например, размещение гидрогеля решение на базе капель или предметы (например, чипсы) на небольших полках, прикрепленных к внутренней поверхности углеродного каркаса стены в высоте, соответствующей позиционирования головки животного.
Мобильная homecage позволяет головные фиксированной животные выполнять широкий спектр двумерных движений, включая горизонтальной передвижения, situp, холить, взбивая, облизывая, нос-тыкать, квалифицированных передние движений лап, и стены прикосновения с передних конечностей, как показано в настоящем исследовании . Использование мобильного homecage и протоколы, представленные здесь, исследователи могут изучать нейронов систему сенсомоторную с высоким уровнем контроля над как условии стимуляциис и поведенческие читать-аутов. Кроме того, исследования познавательных способностей в бодрствующих мышей могут быть выполнены во время выдержки, пространственной навигации и задач принятия решений.
Есть несколько практических ограничений этого метода. Во-первых, значительное количество сжатого воздуха необходим для достижения homecage-подъемную силу и выполнять длительные эксперименты. Во-вторых, мобильный homecage в ее настоящем осуществлении всего 18 см в диаметре, и, следовательно, обеспечивает относительно небольшое пространство и простой по сравнению с виртуальной реальности, где сложный экспериментальный среда может быть выполнен без каких-либо пространственных ограничений. В-третьих, во время усов стимуляции и экспериментов вознаграждения на основе представленных здесь, устройство было использовано, что ограничивает возможность настенного-контакт для мыши. Добавление внешнего визуального или сенсорной стимуляции канала (например, глазной-направленный луч проектора) потребует разработки более эргономичным и компактное устройство по сравнению сМножественные экраном или купольного проекционные решения, которые были использованы в сферических экспериментов беговой дорожке.
Таким образом, использование головных фиксированной мышей, движущихся в воздушно-поднял мобильного homecage значительно облегчает исследования, которые сочетают клеточные, молекулярные и поведенческие уровни наблюдения и манипуляции в одном эксперименте. Специфические области применения, показанные здесь, включают двухфотонного микроскопических изображений, внутреннюю изображений оптического сигнала и патч-зажим записи в не-наркозом ведет себя мышей. Ожидается, что такой подход откроет новые горизонты в экспериментах на активный, ведет себя мыши и служить в качестве полезного инструмента для обоих разработки лекарств и фундаментальных исследований функции мозга.
The authors have nothing to disclose.
Авторы выражают благодарность профессору Ээро Кастреном за ценные замечания по рукописи. Работа выполнена при поддержке грантов от Академии Финляндии, Центр международной мобильности Финляндии, и финской Высшей школы неврологии (Brain и разум докторской программы).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Tweezers Stainless Steel, 115mm | XYtronic | XY-2A-SA | |
Animal trimmer, shaving machine | Aesculap | Isis GT420 | |
Binocular Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
Biological Temperature Controller with stainless steel heating pad | Supertech | TMP-5b | |
Blunt microsurgical blade | BD | REF 374769 | |
Borosilicate tube with filament | Sutter Instruments | BF120-69-10 | For patch pipette production |
Camera | Foscam | FI8903W | Night visibility |
Carprofen | Pfizer | Rimadyl vet | |
Dental cement | DrguDent, Dentsply | REF 640 200 271 | |
Dexamethasone | FaunaPharma | Rapidexon vet | |
Disposable drills | Meisinger | HP 310104001001008 | |
Dulbeco’s PBS 10X | Sigma | D1408 | |
Dumont #5 forceps, 110 mm | FST | 91150-20 | |
Eyes-lubricant | Novartis | Viscotears | For eyes protection during operation and as viscose solution for immersion |
Foredom drill control | Foredom | FM3545 | |
Foredom micro motor handpiece | Foredom | MH-145 | |
Four-winged metal holder | Neurotar | ||
Head Holder for Mice | Narishige | SG-4N | Assembled on stereotaxic instrument |
Hemostasis Collagen Sponge | Avitene, Ultrafoam BARD | Ref 1050050 | |
Imaris | Bitplane | ||
Ketamine | Intervet | Ketaminol vet | |
Kwik-Sil | WPI | ||
Mai Tai DeepSee laser | Spectra-Physics | ||
Micro dressing forceps, 105 mm | Aesculap | BD302R | |
Microelectrode puller | Narishige | PC-10H | Vertical puller for glass pipette production |
Micromanipulator | Sensapex | ||
Mini bolt | Centrostyle | Ref. 00343 s/steel M1.0x4.5 | |
Mobile Homecage | Neurotar | ||
Multiphoton Laser Scanning Microscope | Olympus | FV1000MPE | |
Nonwoven swabs 5×5 | Molnlycke Health Care | Mesoft | Surgical tampons |
Polyacrylic glue | Henkel | Loctite 401 | |
Round glass coverslip | Electron Microscopy Sciences | ||
1.5 thickness | |||
Small animal stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900 | |
Student iris scissors, straight 11.5 cm | FST | 91460-11 | |
Xylazine | Bayer Health Care | Rompun vet |