Flat-floored Air-løftet Platform: En ny metode for å kombinere Behavior med Mikros eller Elektro på Awake fritt bevegelige Gnagere

Summary

This method creates a tangible, familiar environment for the mouse to navigate and explore during microscopic imaging or single-cell electrophysiological recordings, which require firm fixation of the animal’s head.

Abstract

Det er allment anerkjent at bruk av generell anestesi kan undergrave relevansen av elektrofysiologiske eller mikroskopiske data innhentet fra et levende dyr hjerne. Videre er den omstendelige gjenvinning fra anestesi begrenser frekvensen av gjentatte opptak / avbildnings episoder i langsgående studier. Derfor er nye metoder som ville tillate stabile opptak fra ikke-bedøvede oppfører mus ventes å avansere innen cellulære og kognitive nevrovitenskap. Eksisterende løsninger spenner fra ren fysisk tvang til mer avanserte metoder, som lineære og sfæriske tredemøller brukes i kombinasjon med datagenerert virtuell virkelighet. Her er en ny metode som er beskrevet der en head-fast mus kan flytte rundt en luft-løftet mobile homecage og utforske omgivelsene under stress-frie forhold. Denne metoden gjør det mulig for forskere å utføre atferdstester (f.eks, læring, tilvenning eller roman objekt gjenkjenning) samtidig medto-foton mikroskopisk avbildning og / eller patch-clamp opptak, alle kombinert i et enkelt eksperiment. Dette video-artikkelen beskriver bruken av våkne dyr hode fikseringsanordning (mobil homecage), demonstrerer fremgangsmåten av animalsk tilvenning, og eksemplifiserer en rekke mulige anvendelser av fremgangsmåten.

Introduction

En spennende ny trend i Neurosciences er å utvikle eksperimentelle tilnærminger for molekylær-og celle sondering av nevrale nettverk i hjernen av våken, oppfører gnagere. Slike tilnærminger holder lover å kaste nytt lys over nevrofysiologiske prosesser som ligger til grunn motorisk funksjon, sensorisk integrasjon, persepsjon, læring, hukommelse, samt skade progresjon, nevrodegenerasjon og genetiske sykdommer. Videre opptak fra våken dyrets hjerne holder løftet i utvikling av nye terapeutiske midler og behandlinger.

Det er en økende bevissthet om at anestesi, noe som har vært vanlig i nevrofysiologiske eksperimenter, kan påvirke de grunnleggende mekanismene for hjernens funksjon, som potensielt kan føre til feilaktige tolkning av eksperimentelle funn. Dermed blir mye brukt bedøvelse ketamin øker hurtig dannelse av nye dendrittutløperne og forbedrer synaptiske funksjon ^1; En annen mye brukt anesthetic isofluran ved kirurgisk anestesi nivåer helt undertrykker spontan kortikal aktivitet i nyfødte rotter og blokkerer spindel-burst svingninger i voksne dyr ^2. I dag er bare et begrenset antall tilnærminger aktiver eksperimenter i ikke-bedøvet mus ved hjelp av to-foton mikroskopisk bildebehandling eller patch-clamp opptak. Disse metodene kan deles inn i fritt bevegelige og hode-faste preparater.

Den unike attraktivitet av et fritt bevegelige dyr preparatet er at det tillater vurdering av naturlig atferd, inkludert hele kroppsbevegelser under navigasjon. En måte å bilde inne i hjernen til en fritt glidende gnager er å feste en miniatyrisert hodemontert mikroskop eller fiberskop ^3-5. Men miniatyriserte enheter har en tendens til å ha begrenset optisk ytelse i forhold til objektiv-basert to-foton mikroskopi, og kan ikke være lett kombineres med hele cellen patch-clamp opptak ^seks.

Den exibrodd løsninger for hode-feste en våken gnager har stolt primært enten på fysisk tvang ^7,8 eller på trening dyret til å stille frivillig hodestøttene ^ni. En annen populær metode er å la dyrets lemmer å flytte ved å plassere den på, for eksempel, en sfærisk tredemølle ^10; denne tilnærmingen er ofte kombinert med datagenerert virtuell virkelighet. Elektrofysiologiske eksperimenter på hode-fast mus har for det meste brukt ekstracellulære innspillinger og ble brukt til å studere sentrale regulering av kardiovaskulær funksjon ^11, effektene av anestesi på nerveaktiviten ^12, hørsels respons i hjernestammen ¹³ og informasjonsbehandling ^14. Den banebrytende intracellulære / hel-celle opptak i våken oppfører dyr ble utført på 2000-tallet, og har fokusert på nevral aktivitet knyttet til persepsjon og bevegelse ^15-20. Rundt samme tid ble de første mikroskopiske imaging studier på våken mus pubblert, hvor to-fotonmikroskopi ble anvendt i det sensoriske cortex i rotter fysisk i setet ^7, og på mus som kjører på en sfærisk tredemølle ^21..

Påfølgende in vivo mikroskopi og elektrofysiologiske studier viste at et hode fiksering forberedelse kan med hell kombineres med atferds paradigmer basert på forbena bevegelser, lukt anerkjennelse, visping, og slikker ^8,22-25. Mus plassert på sfærisk tredemølle kan trenes til å navigere i virtuelle visuelle miljøet generert av en datamaskin ^10,26. Intracellulære / ekstracellulære opptakene viste at i en head-fast dyr navigerer slikt virtuelt miljø, kan aktivering av hippocampus sted celler oppdages ^27. I en virtuell visuelle miljøet, mus viser normal bevegelse relaterte theta rytme i det lokale feltet potensial og theta-fase presesjon under aktiv bevegelse ^27. Nylig, den romlige og tidsmessige activity mønstre av nevronale populasjoner ble registrert optisk mus i løpet av arbeidsminnet beslutning oppgaver i et virtuelt miljø ^28.

Til tross for å ha slått banebrytende forskning, har den sfæriske tredemølle utformingen flere iboende begrensninger. Først er det dyret som kreves for å flytte på et ubegrenset overflaten av en roterende luft løftet ballen, noe som utgjør ingen konkrete hindringer som vegger eller hindringer. Denne begrensningen er bare delvis kompensert av datagenererte "virtuell virkelighet", for visuell inngang er kanskje mindre effektive på mus og rotter i forhold til det taktile sanseinntrykk (som whisker-trykks-eller slikke), hvor disse arter naturligvis avhengige på. For det andre kan en betydelig krumning av kulens overflate være ubehagelig for laboratoriemus som brukes til å vandre på et plant gulv i burene. Til slutt gjengir selve diameteren på ballen (minst 200 mm for mus og 300 mm for rotter) den vertikale størrelsen på sfærisktredemølle enhet relativt stor. Dette gjør det vanskelig å kombinere sfærisk tredemølle med de fleste kommersielt tilgjengelige mikros oppsett, og krever ofte å bygge et nytt oppsett rundt tredemølle ved hjelp av skreddersydde mikroskop rammer.

Her er en ny metode som er beskrevet der en head-fast mus kan flytte rundt en luft-løftet mobile homecage som har flatt gulv og konkrete vegger, og utforske det fysiske miljøet under stress-frie forhold. Denne artikkelen viser prosedyrene for musetrening og hodet fiksering, og gir representative eksempler der to-foton mikroskopi, iboende optisk bildebehandling og patch-clamp opptak er utført i hjernen av våken oppfører mus.

Protocol

Alle de prosedyrer som presenteres her ble utført i henhold til lokale retningslinjer for dyr omsorg (Den finske loven om forsøk med dyr (62/2006)). Dyret lisens (ESAVI/2857/04.10.03/2012) ble innhentet fra kommunen (ELÄINKOELAUTAKUNTA-ELLA). Voksne mus (alder 1-3 måneder, vekt 20-40 g) ble holdt i gruppe-boliger bur i den sertifiserte dyret anlegget ved Universitetet i Helsinki og utstyrt med mat og vann ad libitum. En. Kraniell Vindu Implantasjon Cranial vinduet er implantert i henhold til publiserte protokoller 29-31 med mindre modifikasjoner, som kort beskrevet nedenfor: Sterilisere instrumentene før du starter kranie vindu implantasjon. Oppretthold sterile forhold under en operasjon for å redusere risikoen for postoperative komplikasjoner. Administrere et analgetikum (Ketoprofen, 2,5 mg / kg) 30 minutter før operasjonen, og 24 timer etter kirurgi. Enesthetize musen ved hjelp av en blanding av ketamin (80 mg / kg) og xylazin (10 mg / kg) injisert intraperi-tonealt. Regelmessig overvåke anestesidybden ved pote klemming. Bruk en varmepute for å opprettholde dyrets kroppstemperatur ved 37,0 ° C. For å redusere kirurgi-indusert inflammasjon og cerebralt ødem, gi deksametason (2 mg / kg) ved sub-kutan injeksjon. Påfør øye smøremiddel for å beskytte øynene fra å bli tørr. Barbere musa hode og rengjør det barberte området. Kutt i huden ved hjelp av kirurgisk saks og pinsett langs linjen fra Scruff til pannen. Fjern eventuelle bindevev festet til skallen. Sakte og forsiktig bore et lite godt på venstre frontal bein ved hjelp av en høyhastighets kirurgisk drill. Skru et mini bolt (se Materials) inn i boret brønn. Utfør ikke mer enn en-og-en-halv omdreininger på skruen. MERK: Unngå de områdene som er plassert rett over de overfladiske kortikale fartøy. Forstyrrelse av disse vesSels kan føre til massive blødninger. For å utføre kraniotomi, bore et sirkulært vindu (3-3,5 mm i diameter) i høyre issebeinet. Påfør en dråpe av cortex buffer (125 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM glukose, 10 mM HEPES, 2 mM CaCl 2, og 2 mM MgSO 4 i destillert H2O supplert med penicillin 100 enheter / ml og streptomycin 100 ug / ml) og forsiktig fjerne en del av benet som ligger inne i den sirkulære vinduet. NB: For å uttrykke et fluorescerende protein i en bestemt undergruppe av celler, utføre intrakranial injeksjon av adeno-assosiert virus (AAV) vektor eller andre virale vektorer på dette punkt i fremgangsmåten. Plasser en runde glass dekkglass (# 1.5 tykkelse kode) på kranie vinduet. Fest dekk til skallen med polyakryl lim. Plasser en metallholderen på toppen av dekkglass og fikse det med en blanding av dental sement og polyacrylic lim. MERK: Fremgangsmåten er beskrevet ovenfor er optimalisert for kranie vinduerbrukes i optiske bildebehandling eksperimenter. For å fremstille en "invertert" cranial vinduet er egnet for elektrofysiologiske eksperimenter, brukes en annen fremgangsmåte. Først limer metallholderen til skallen. Bor et sirkulært vindu i innehaverens åpning som eksemplifisert i videoen. Alternativt kan en mindre kraniotomi (mindre enn 0,5 mm i diameter) over området av interesse for å forhindre eller minimalisere hjerne bevegelsen 32.. Oppdater kortikale buffer eller plassere en dråpe silikon på kranie vinduet, og lukk den med en rund glass dekkglass. Etter fullføring av operasjonen, plasseres dyret i en oppvarmet bur med lett tilgjengelige mat og vann. Returner dyret til gruppen-boliger bur bare etter det blir helt frisk fra anestesi. Re-administrere smertestillende ved oppdage eventuelle tegn på smerte, inkludert motvilje mot å bevege seg, spise eller drikke, vekttap, spyttsekresjon, bustepels eller unormale lyder respiratoriske. 2. Animal Håndtering Ta musen fra buret sitt og bare holde det for 5-10 min. Være rolig mens håndtering av dyr, unngå å lage jerky bevegelser og lyder. Etter håndtering returnere musen til buret sitt. Gjenta behandlingen prosedyren 2-3x med ulik intervaller mellom håndtering episoder, for å gjøre musa komfortabel med experimentalist. Ta en liten myk fille og pakk dyret 2-3x med ulik intervaller. Animal bør forbli rolig og bli vant til å være innpakket. Hvis musen er spent og nervøs, gjentar håndtering og innpakning prosedyrer. Tre. Animal Training Begynn opplæring av dyr i den mobile homecage neste dag etter tilvenning til håndtering og pakking er fullført. Spill dyrets veie daglig før og under trening. MERK: Hvis du under trening, mister dyret over 10% av vekten sin, det bør utelukkes fra than eksperimenter. Justere den vertikale posisjonen av hodet fiksering arm av den mobile homecage enhet for å samsvare med størrelsen av trenet dyret. Kople til luftinntaket av apparatet til den standard laboratorie trykksatt luftutløp (vanligvis enten en gasstank eller en luft-pumpe som gir et tilstrekkelig høyt trykk og hastighet av luftstrømmen, det vil si omtrent 5 bar og 300 l / min). Pakk dyret i en fille. Sett metallholderen, som er festet til dyrets hode, inn i hodet fiksering arm og godt fikse det ved å stramme skruene. Slå på luftstrømmen og sørge for at luftstrømmen er optimal for fri stiftelse av luft-løftet homecage. Slipp dyret inn i mobil homecage ved å fjerne fille. For å tilvenne dyret til støy, gir en konstant eksponering til lyder fra omgivelsene (ved anvendelse av for eksempel radio eller innspilt musikk og tale) ved alle trenings såvel som under forsøkene. DUrering første treningsøkt, holde rommet lys på den første timen, deretter slå av lyset fram til slutten av treningsøkten. Etter to timers trening i mobil homecage, slipper dyret fra hodet fiksering og returnere den til buret sitt med en tilførsel av vann og mat. La den stå i minst to timer under liggeforhold. Rengjør mobilen homecage etter hver treningsøkt ved hjelp av en 70% etanol løsning og skyll den med vann fra springen. Sug opp vannet med engangs papirhåndkle og tørk mobil homecage før neste gangs bruk. Utfør sammenhengende treningsøkter for 2 timer, med rommet lyset slått av mens dyret er under opplæring. Utfør treningsøkten to ganger daglig. Etter 8 til 12 trening, brukes dyret i en eksperimentell sesjon i opp til 2 timer ved en tid. MERK: Under langvarige treningsøkter som varer mer enn 1-2 timer, bør du vurdere å gi musen wed drikkevann, som kan leveres enten manuelt eller ved hjelp av en pipette holder festet til det mobile homecage rammen. Alternativt kan vann tilføres for ad libitum bruk av dyret ved å plassere viskøse dråper av hydro-gel direkte på veggene av den mobile homecage være. MERK: Husk å veie dyrene hver dag før trening for å utelukke eventuelle kroniske stress effekter. Ekskluder et dyr fra eksperimentet hvis, på ethvert tidspunkt, demonstrerer det stressreaksjoner som frysing, stemmebruk, eller stress-indusert diaré. 4. Søknader To-foton Imaging i Awake Mouse Flytte Rundt Mobile Homecage Monter mobil homecage. Sjekk posisjoner av broen og hodet fiksering arm. Pakk trent dyr i en fille. Plasser dyret i den mobile homecage. Klem metallholderen i hodet festearmen. Fjern fille. Rengjør implantert cover glass fra støv meden 70% etanol løsning og la den tørke. Plasser en dråpe av fluid nedsenking på deksel klasse. Fortrinnsvis brukes en viskøs løsning, fordi vann vil fordampe raskt. Plassere mobil homecage enheten med trent dyr under mikroskopet (med mindre du har en annen, identisk enhet, som står stille i mikros setup). Utfør bildebehandling ved hjelp av enten en skreddersydde eller en kommersielt tilgjengelig laser-scanning mikroskop imaging system utstyrt med en femtosecond pulset infrarød laser. Finn regionen av interesse ved bruk av den brede feltmodus for fluorescensmikroskop. Bruk lange pass filter for å vurdere hjernens blodkar og velg et passende målområdet etter å ha undersøkt mønsteret av blodkar. Slik bilde kortikal vaskulatur, injiserer en 1% oppløsning av 70000 MW Texas Red-konjugert dekstran (eller dens analog), enten inn i halevenen, mens dyret er immobilisert i det rag, eller retro-orbitale mensdyret er plassert i den mobile homecage. Tune to-foton laser til 860 nm og bruke band pass filter (590-650 nm) til å samle lyset. Bruk 515-560 nm utslipp filter for å vurdere de fine detaljene i neuronal morfologi eller nerveaktiviten utnytte, for eksempel transgene mus som uttrykker YFP eller Ca 2 + – sensitive fluorescerende protein GCaMP3 i en undergruppe av nerveceller under Thy1 arrangøren. Bruk en passende programvare for bildeopptak. Etter bildebehandling, slipper dyret fra hodet fiksering arm ved å løsne skruene. Returner dyret til buret sitt og la den hvile i minst 2 timer før du starter neste bildebehandling økten. Oppbevar koordinatene for hver region av interesse (ROI) for påfølgende reimaging. Bilde samme ROIs over tid, og justere koordinater hver gang for å maksimalisere bildeoverlapper hverandre. Analysere bildene og lage tredimensjonale rekonstruksjoner ved hjelp av en passende prog.vareer (f.eks ImageJ, etc.). Intrinsic Optisk Imaging i Awake Mouse Flytte Rundt Mobile Homecage Monter mobil homecage under bildet oppkjøpet kamera av en iboende optisk avbildning oppsett. Pakk trent dyr i en fille. Plasser dyret i den mobile homecage. Klem metallholderen inn i hodefikser arm. Rengjør implantert cover glass fra støv med en 70% etanol løsning og la den tørke. Plasser en dråpe glyserol på implantert glass og dekke den med et 8 mm runde dekkglass. Plasser en manipulator med luft-blow tube motsatt til kontralaterale vibrissa. Justere posisjonen til høyhastighetskamera og fokusere den på kortikale vaskulatur. Bruk grønt lys (filter 546BP30) uten kamera filter for å skaffe kartet til fartøyene. Fokus dypere inn i hjernebarken, ca 400 mikrometer under kortikale overflaten. Til bilde than blod oksygenenivåavhengig (BOLD) optisk signal, plasserer 590LP filter foran kameraet og belyse cortex med rødt lys (filter 630BP30). Juster belysning av kortikale overflate slik at det blir jevnt fordelt gjennom regionen av interesse, å unngå overeksponering. Juster belysningsintensitet, slik at området av interesse faller innenfor 70-90% delen av kameraets dynamiske område. Bruk LongDaq image oppkjøpet programvare for å samle inn bilder fra kameraet. Bruk image oppkjøpet frekvens på 1 til 10 Hz (dvs. mellom 1 og 10 bilder per sekund) for eksperimenter med lav frekvens stimulering (0,05 Hz). Slå av lyset i rommet for å forhindre interferens med de iboende optiske signal. La det være minst 30 min for musen for å tilpasse seg den mobile homecage. Bilde grunnlinjen aktivitet under en 6-minutters episode uten stimulering. For å ta opp fremkalt cortical aktivitet, stimulere vibrissa i en 10 sek ON/10 sek OFF-modus (0,05 Hz stimulering) med en høy frekvens (25 Hz) tog av luft puffs for den totale perioden med 6 min. Etter image oppkjøpet, slipper du muse fra hodet fiksering arm og returnere den til buret sitt. Bruk ikke ytterligere data filtrering for frekvens, fordi amplitudene av stimuleringsrespons har en tendens til å være forholdsvis høy i våken dyr, noe som resulterer i utmerket signal-til-støy-forhold. Konverter de oppnådde sett med bilder til *. Tif stabelen filer og analysere dem ytterligere hjelp, for eksempel, den åpen kildekode FIJI programvare (ImageJ). Trekk fra baseline spontan aktivitet fra rammene fremstilt under vibrissa stimulering ved hjelp av bilde Calculator verktøyet. Alternativt kan filterdata i frekvensdomenet ved hjelp av passende programvare. Patch-clamp Recordings i Awake Mouse Flytte Rundt Mobile Homecage Monter mobil homecage. Pakk trent dyr i en fille. Administrer trimethoprime (5 mg / kg) og sulfadoxine (25 mg / kg) for å forhindre bakterieinfeksjon. Plasser dyret i den mobile homecage. Klem metallholderen inn i hodefikser arm. Rengjør og steriliser implantert dental sement "cap" og cover glass ved hjelp av en 70% etanol løsning eller 0,5% klorheksidin digluconate og la den tørke. Sakte og forsiktig fjerne dekkglass fra metallholderen. Oppdater kortikale buffer supplert med penicillin, streptomycin og rense skallen vindu fra rusk med en steril hemostatic tampong. Plasser jordelektroden inn i det kortikale buffer. Plasser elektrofysiologi heads i en micromanipulator. Dikte pipetter fra borsilikatglass, med sikte på spissen motstand som strekker seg fra 6,5 ​​til 8.5MΩ. Fyll lappen pipette med en intracellulær løsning. Sammensetningen av plasteret pipette løsning erfølgende (i mM): 8 KCl, 111 K-glukonat, 0.5 CaCl 2, 2 NaOH, 10 glukose, 10 HEPES, 2 Mg-ATP, og 5 BAPTA, ble pH justert til 7,2 med KOH. Membranpotensialet verdier må korrigeres for en beregnet flytende krysset potensial på -12 mV 33. Target regionen av interesse å bruke stereotaksiske koordinater, og raskt flytte elektroden inn i hjernen og samtidig opprettholde sterk positiv press på pipettespissen. Etter dura mater penetrasjon og pipetten posisjonering, måle spissen motstand og forkaste de elektroder som viser en økning i motstand på mer enn 10 til 15%, for å forbedre den suksessraten av de etterfølgende trinn. Reduser positivt trykk til det halve for å unngå svelling av det omkringliggende hjernevev. Ytterligere tiltak er lik standard "blind flekk" protokollen. For å finne et nevron å ta opp fra, senke tuppen inn i hjernen i en stegvis inntil en nervecelle er oppdaget i en nær proximity av pipettespissen, som angitt med en karakteristisk tidsmessige sekvens av elektrode-impedans-endringer. Den viktig indikator på tilstedeværelsen av en neuron er en monoton økning i elektrodemotstanden på tvers av flere etterfølgende trinn fremover i pipetten (vanligvis en 20% økning i pipetten motstand over tre 2-mikrometer trinn). For å danne en gigaseal kontakt med målrettet neuron, anvende et negativt trykk, og hyperpolarisering av pipetten. Påfør en kort puls på et større undertrykk i cellen for å etablere den hel-cellekonfigurasjonen. Trekk elektroden med 2-3 mikrometer for å holde en god tetning. Record spontan eller fremkalt aktivitet i løpet av en ønsket tidsperiode, opp til 20 til 40 min. Etter innspilling, fjerne pipetten fra hjernen. Oppdater kortikale buffer eller plassere en dråpe silikon på kranie vinduet, deretter lim en runde glass dekkglass på toppen av metallholderen. Slipp animal fra hodet fiksering arm ved å løsne skruene. Retur dyret til buret i minst en dag før den neste registrering. Analysere data med, f.eks, den Fitmaster programvare. Tilvenning-dishabituation Olfactory Test i Awake Mouse Flytte Rundt Mobile Homecage Fest et rent bomullsstykke (2 x 2 cm) dyppet i vann fra springen til den indre side av veggen av den mobile homecage ved hjelp av en to-sidig tape. Del den mobile homecage veggen i fire soner ved å plassere fargemerker på yttersiden av veggen, slik at den del av bomull er plassert i midten av "target-sone". Løser dyret i headholder armen som vender mot veggsegment motsatt til "mål"-sonen og tillate den å tilpasse seg til den mobile homecage i 30 min. Ta et annet stykke av ren bomull og fukte den med noen dråper av 1% vanilje ekstrakt. Erstatte ren bomull på mobil homecage vegg med den som bærer Vanilla lukt. Presentere lukten for 5 min. Spore bevegelsene til mobil homecage løpet lukten presentasjonsperioden. Estimer nivået av interesse for lukten ved å måle den akkumulerte tid som dyret bruker vender "mål"-sonen i forhold til den totale tiden for mobile homecage bevegelse. Gjenta 5-min applikasjonssesjonen tre ganger ved hjelp av lukt av vanilje, med en 5 min inter-sesjon intervall. Bruk en frisk stykke "vanilla" bomull i hver økt. Presentere dyret med en samfunnsmessig betydning lukt under siste, femte sesjon. Fukt et rent stykke bomull med noen dråper urin (fremstilt på den foregående dagen fra et dyr av motsatt kjønn) og plassere den på midten av målsonen i 5 min. Novel lukt anerkjennelse i våken mus bevegelse rundt mobil homecage Fordel veggen i fire soner ved å plassere fargemerker på yttersiden av den mobile homecage veggen. AttACH to rene bomullsstykker (2 x 2 cm) dyppet i vann fra springen til innersiden av veggen i midten av sonene mot hverandre (betegnet som målsone 1 og målsonen 2). Fest dyr i headholder arm overfor en vegg segment utenfor av pulssoner og la den til å tilpasse seg den mobile homecage for 30 min. Bytt begge bomulls stykker med de ferske som:. Sted en bomulls stykke våt med 1% vanilje ekstrakt å målrette sone 1 og en annen våt med vann fra springen å målrette sone to Record video av de mobile homecage bevegelser for 10 min i løpet av lukt presentasjon økten. Beregn lukten deltar som prosentandelen av tiden som dyret bruker overfor målsonen en relativ akkumulert tid brukt overfor soner en og to. Etter en 10 minutters intervall, plassere et annet par av applikatorene på homecage veggen for den etterfølgende 10 minutters periode. Plasser "vanilla" bomull i målsonen en og bomull applikator våt med en% banan eXtract i målsonen to. Gjør et videoopptak av mobil homecage bevegelser. Beregn preferanse til romanen lukt som prosentandel av tiden som dyret bruker mot veggen segmentet med romanen lukt (målsonen 2) i forhold til akkumulert tid vender soner en og to.

Representative Results

The method presented here is intended for microscopic imaging or single-cell electrophysiological recordings in awake, head-fixed but otherwise freely-moving and behaving mice. The animal can move in two dimensions in a real (as opposed to virtual), tangible and familiar environment, while the animals’ skull is fixed firmly to the head fixation arm. Habituating the mice to the air-lifted mobile homecage consists of 4-6 days of twice-daily 2-hr training sessions (Figure 1). The trained animals can then be used in the experiments immediately. A typical study includes a number of imaging sessions or patch-clamp recording sessions that are spaced at intervals ranging from few hours to several days or weeks. Importantly, both optical and electrophysiological recordings can be performed simultaneously with cognitive or behavioral stimuli and readouts, within a single experiment. To evaluate the mechanical stability of mouse’s head fixation in the mobile homecage, the image sequences of cortical vessels labeled with fluorescent-conjugated dextran and of cortical dendrites expressing YFP were collected while the experimental animals were navigating the mobile homecage (Figure 2). The maximal displacements of the brain during animal’s locomotion did not typically exceed 1-1.5 micrometers. These displacements occurred in the horizontal directions and very rarely resulted in a detectable shift of the imaging plane, rendering unnecessary any correction of motion artifacts. Stable head fixation in mobile homecage allows quantification of individual dendritic spines in awake animals with the same reliability as in anesthetized mice. Dendritic spine density, morphology and turnover can be monitored during longitudinal studies with multiple imaging sessions performed at intervals ranging from a few hours to several days or weeks. The usability of the mobile homecage for functional optical imaging was tested in somatosensory cortex of awake mice using two approaches: i) two-photon microscopy on the Thy1-GCaMP3 transgenic mice and ii) intrinsic optical signal imaging in wild-type mice. Ca2+ imaging was performed in layer 2/3, which contains cell bodies of many fluorescently labeled neurons, as well as their dendrites and axons (Figure 3). The plots of fluorescence-over-time from selected regions of interest (ROIs) are shown in Figure 3, demonstrating spontaneous neuronal activity (measured as transient increases in GCaMP3 fluorescence) during the mouse’s active navigation in the mobile homecage. Optical imaging based on intrinsic signals allows mapping the spatial distribution of functional domains. Figure 4 illustrates wave-like changes in the blood oxygenation level (reflecting regional neuronal activation) that propagated along somatosensory cortex in response to vibrissa stimulation at the frequency of 0.05 Hz. To test feasibility of patch-clamp recordings with mobile homecage, we used 2-3 months-old C57Bl/6J mice. Layer 2/3 neurons in somatosensory cortex were recorded from in whole cell configuration using current clamp mode. Patch-clamp recording in the brain of awake mice head-fixed on mobile homecage was essentially similar to blind patch-clamping in brain slices. Approximately 50% of attempts resulted in successful gigaseal formation, of which more than 70% yielded stable whole-cell configuration recording. No events of losing gigaseal contact due to mechanical displacement of cells were observed. Figure 5 illustrates a 60-sec fragment of a representative 10-min long current-clamp recording correlated with episodes of mouse’s active (running) and passive (resting) states. Figure 1. The method of head fixation of awake mice in the mobile homecage. A) Overview of the air-lifted mobile homecage design and illustrations of the general concept. B) Diagram of a typical experimental timeline. The study begins with implantation of the cranial window two weeks prior to habituating the mouse to handling and wrapping, which is followed by eight twice-daily training sessions. The typical study includes a number of imaging sessions or patch clamp recording sessions that are spaced at intervals ranging from few hours to several days or weeks. Both optical and electrophysiological measurements can be done in parallel with cognitive or behavioral stimuli and readouts within a single experiment. Please click here to view a larger version of this figure. Figure 2. Example of two-photon microscopic imaging on awake mice moving around the mobile homecage. A,B) Cortical vasculature, labelled with the 70 kDa Texas Red-conjugated dextran. The diameter of individual vessel segments is measured by plotting over time the profile of the lines drawn across the vessel lumen during periods of mouse’s resting and running (A). The rate of blood flow in arteries and veins is measured by line-scanning along the lines drawn parallel to the vessel wall (B). C,D) Fine details of neuronal morphology visualized in the brain of transgenic mice that express YFP in subpopulation of neurons under the Thy1 promoter. Three-dimensional reconstruction of pyramidal neurons in the mouse’s somatosensory cortex (C). The images of a dendritic branch acquired in an awake, behaving mouse are sufficiently stable for quantification of individual dendritic spine morphology (D). E) Quantification of brain motion caused by mouse movements. Larger amplitude displacements correlate with periods of the mouse’s running. Please click here to view a larger version of this figure. Figure 3. Example of neuronal population activity in awake Thy1-GCaMP3 mouse moving around the mobile homecage. A) Two-photon image of cortical layer II/III neurons. ROIs, for example neuronal cell bodies, dendrites and axons are shown in yellow. B) ΔF/F traces of the GCaMP3 fluorescence from ROIs shown in A (time series recorded at 1.5 sec/frame). C) Zoomed-in region imaged at 65 msec/frame. D) Fluorescence from yellow ROIs in C plotted over time, shows the transient increases (red) in the GCaMP3 fluorescence that correspond to the action potential-induced Ca2+ influx episodes. Please click here to view a larger version of this figure. Figure 4. Example of mapping the spatial distribution of functional responses in the cortex of an awake mouse by means of imaging the intrinsic optical signals. A) Bright-field view of the superficial blood vessels through the cranial window. B) Magnitude map of the baseline activity in mobile homecage during a 6-min episode. C) Magnitude map of neuronal activity propagating along somatosensory cortex in response to the vibrissa stimulation at a frequency of 0.05 Hz. Please click here to view a larger version of this figure. Figure 5. Example of whole-cell patch-clamp recording in the cortex of an awake mouse moving around the mobile homecage. A) Current-clamp recording from a neuron in the mouse cortical layer 2/3. A 0.5 sec, 100-pA current injection (indicated below the trace) results in a burst of action potentials. The cell showed spike frequency adaptation characteristic for pyramidal neurons. B) Continuous current-clamp recording from the same neuron correlated with the mouse’ locomotor activity (shown in pink above the trace). Representative spontaneous activity of the layer 2/3 neuron during periods of the mouse’s resting (C) and running (D). Please click here to view a larger version of this figure. Figure 6. Animal weight loss and locomotor activity of head-fixed/non-fixed mice during training sessions in the mobile homecage. A) Animal weight (mean+SD,%) before training sessions. Note that weight loss is fully reversed by the 7-8th training session. B) Trajectory of the mouse’s horizontal locomotion relative to the mobile homecage, which was extrapolated from the tracked movement of the mobile homecage during 8th training session. C) Tracked movements of a non-head-fixed mouse exploring the round cage during 8th training session. D) Duration of head-fixed (circle) and non-fixed (triangle) mice movement during 1-4th day of training (mean+SD,%). Note that, on day 4, head-fixed mice display neither freezing (as on day 1) nor excessive locomotor activity. Please click here to view a larger version of this figure.

Discussion

To better understand brain physiology and pathology, research must be performed on a variety of preparation complexity levels, utilizing the most appropriate techniques for each preparation. At present, a wide range of neuroscience methodologies (from full-body fMRI to sub-organelle STED microscopy) are readily applied to anaesthetized animals, while experiments on awake and behaving animals have represented a significant methodological challenge.

Here, a novel approach is described where a laboratory animal, despite being firmly head-fixed, can move around an air-lifted mobile homecage and explore its tangible environment under stress-free conditions. The head-fixed behaving animal preparation presented here provides a number of crucial advantages. First, electrophysiological or imaging data obtained with this method are uncompromised neither by anesthesia nor by constrain-induced stress. Positioning of the mouse into the mobile homecage is quick and does not require anesthetizing the animal even transiently. Second, the air-lifted homecage ensures the mechanical stability that is needed to quantify changes in fine neuronal morphology and to record single-cell electrophysiological activity in awake animals. Finally, the mobile homecage’s design is more compact in comparison to the spherical treadmill, thus allowing positioning the mobile homecage under a standard upright microscope for two-photon imaging or patch-clamp recording in awake mouse’s brain.

Firm head fixation in the mobile homecage requires implantation of a specially designed four-winged metal holder, with a round opening in the center for optical or electrical access to the underlying brain region. These metal holders are attached to the skull by means of a combination of glue, dental cement and a small bolt screwed into the skull bone. This surgical procedure was developed based on a large number of previously published procedures, and was found to result in a stable and reproducible cranial window preparation. For in vivo electrophysiological experiments, a moon-shaped window³⁴, a small size craniotomy (less than 0.5 mm)³², and a drilled glass-covered preparation³⁵ have been utilized. Here, the “inverted” cranial window was implanted with either a large (3.5 mm diameter) or small (less than 0.5 mm diameter) craniotomy. Minimizing brain movement is critical for stable single cell recordings, which is why it is advisable to perform small size craniotomies for electrophysiological experiments. Upon implantation of the cranial window for optical imaging experiments, the animals are allowed to recover for at least 2 or 3 weeks, during which period the window first transiently loses its transparency and then regains it (with a 50-70% yield, depending on the genetic background of the mouse strain). Transparency of the cranial window and stability of the dental cement “cap” attached to the skull can be verified by means of a regular binocular microscope and physical inspection during animal handling. At the end of the 2-3 week recovery period, those animals that exhibit any signs of residual post-operational inflammation or mechanical defects in the dental cement should be excluded from the experiments and terminated.

The optimal age for starting training the mice is 2-4 months (corresponding to the body weight of 20-40 g). In younger animals, anchoring of the dental cement “cap” to the skull can be unreliable, which may decrease its resilience to the mechanical stress that is imposed by locomotion of the head-fixed mouse in the mobile homecage. Although male and female mice appear equally willing to navigate in mobile homecage, there is a tendency to achieve better percentage of cranial windows regaining their transparency in female mice (data not shown). Hence, in order to ensure a balanced mix of genders in the cohort of animals selected for imaging, implanting cranial windows in approximately 30% more male mice is recommended. Social interactions are known to improve the animals’ well-being and reduce stress, therefore it is advisable that littermates are operated and trained in parallel and kept together in group-housing cages.

In contrast to the procedures published for the spherical treadmill preparation¹³, the method utilizing the mobile homecage does not require anesthetizing the mouse at the moment of head fixation. This difference is important because it allows to rule out any residual effects that even a brief and “light” anesthesia episode is likely to have on the physiological measurements obtained shortly after. Indeed, even though in the studies where head fixation was done under anesthesia and the actual experiments were started after a brief waiting period¹³, one cannot exclude possible long-lasting effects of the brief anesthesia episode on the experimental data. Other studies have relied on water deprivation for systematic habituation of the animals to head fixation and used water reward as the means of motivating the animal to remain immobile³⁶. However, the reward-based head fixation method limits the choice of applicable behavioral tests and, importantly, occupies one of the well-established stimulus–reward associations. In contrast, the method of mouse habituation to head fixation in mobile homecage does not require water deprivation and subsequent reward.

Supplementing the mobile homecage with a water delivery system is recommended for long-lasting experiments. The animal training sessions and experiments presented here were done during daytime (between 8 a.m. and 6 p.m.), which corresponds to the physiologically passive period for those mice that are kept under the standard 12-hr light schedule (lights on at 6 a.m. and off at 6 p.m.). Since the water intake is directly associated with the mouse’s activity, during the passive period mice do not require water delivery if the duration of a training/imaging/recording session does not exceed 2 hr. In addition to the timing and duration of the training sessions, one needs to address the issue of the optimal number of sessions required for habituating the animals to mobile homecage. To this end, two criteria were used to evaluate stress induced by head fixation procedures: i) weight loss, and ii) locomotor activity level. As shown in Figure 6, weight loss reaches the average level of 6% on training day 2, and is completely reversed by training day 4 (Figure 6A). Consistently with the weigh dynamics, the locomotor activity level of head-fixed animals is suppressed on the first day of training but stabilizes by training day 4 (Figure 6D). Based on these measurements, we suggest that the minimal duration of the mouse training period on mobile homecage is 4 days, as described in the protocol hereby.

Use of the air-lifted, flat-floored mobile homecage allows adding complex tasks (sensorimotor, perceptional, and cognitive) to the training paradigms for head-fixed mice. In the present study two protocols of behavioral tests are presented. Both protocols utilize odor cues and can be combined with longitudinal imaging/recordings in the mouse cortex. Although the mobile homecage is manufactured from nonabsorbent materials, one still needs to take into account possible interferences between the smell of the device and test odor(s). Another factor that may interfere with visual/tactile cues of a behavioral experiment is the junction between the wall and the insert, which is not seamless and may, therefore, be perceived by the animal as a landmark. It is worth noticing here that, in order to minimize animal’s distress during such interventions as placement of an odor-presenting cotton to the mobile homecage wall, the experimentalist should practice to perform such interventions as quickly as possible and avoid prolonged handling of the carbon cage. Alternative strategies for novel smell/object presentation are conceivable, e.g., placing hydrogel-based solution drops or objects (such as food chips) onto small shelves attached to the inner surface of the carbon cage wall at the height compatible with the animal’s head positioning.

Mobile homecage allows head-fixed animals to perform a wide range of two-dimensional movements including horizontal locomotion, situp, grooming, whisking, licking, nose-poking, skilled front paw movements, and wall touching with forelimbs, as illustrated in the present study. Using mobile homecage and the protocols presented here, researchers can study the sensorimotor neuronal system with a high level of control over both the stimulation conditions and the behavioral read-outs. Furthermore, studies of cognitive abilities in awake mice can be performed during conditioning, spatial navigation and decision-making tasks.

There are several practical limitations of this method. First, a significant amount of pressurized air is needed to achieve the homecage-lifting power and to perform long-lasting experiments. Second, the mobile homecage in its present implementation is only 18 cm in diameter, and therefore provides a relatively small and simple space in comparison to virtual reality, where a complex experimental environment can be designed without any spatial restrictions. Third, during whisker stimulation and reward-based experiments presented here, a device was used that limits the possibility the wall-contact for the mouse. Addition of an external visual or sensory stimulation channel (such as an eye-directed light projector) would require designing a more ergonomic and compact device in comparison to the multiple-screen or dome-projection solutions that have been used in the spherical treadmill experiments.

In summary, the use of the head-fixed mice moving in the air-lifted mobile homecage greatly facilitates the studies that combine cellular, molecular and behavioral levels of observation and manipulation within a single experiment. Specific applications illustrated here include two-photon microscopic imaging, intrinsic optical signal imaging and patch-clamp recordings in non-anesthetized behaving mice. It is expected that this approach will open new horizons in experimentation on awake, behaving mouse and serve as a useful tool for both drug development and basic research of brain function.

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Tweezers  Stainless Steel, 115mm	XYtronic	XY-2A-SA
Animal trimmer, shaving machine	Aesculap	Isis GT420
Binocular Microscope	Zeiss	Stemi 2000
Biological Temperature Controller with stainless steel heating pad	Supertech	TMP-5b
Blunt microsurgical blade	BD	REF 374769
Borosilicate tube with filament	Sutter Instruments	BF120-69-10	For patch pipette production
Camera	Foscam	FI8903W	Night visibility
Carprofen	Pfizer	Rimadyl vet
Dental cement	DrguDent, Dentsply	REF 640 200 271
Dexamethasone	FaunaPharma	Rapidexon vet
Disposable drills	Meisinger	HP 310104001001008
Dulbeco’s PBS 10X	Sigma	D1408
Dumont #5 forceps, 110 mm	FST	91150-20
Eyes-lubricant	Novartis	Viscotears	For eyes protection during operation and as viscose solution for immersion
Foredom drill control	Foredom	FM3545
Foredom micro motor handpiece	Foredom	MH-145
Four-winged metal holder	Neurotar
Head Holder for Mice	Narishige	SG-4N	Assembled on stereotaxic instrument
Hemostasis Collagen Sponge	Avitene, Ultrafoam BARD	Ref 1050050
Imaris	Bitplane
Ketamine	Intervet	Ketaminol vet
Kwik-Sil	WPI
Mai Tai DeepSee laser	Spectra-Physics
Micro dressing forceps, 105 mm	Aesculap	BD302R
Microelectrode puller	Narishige	PC-10H	Vertical puller for glass pipette production
Micromanipulator	Sensapex
Mini bolt	Centrostyle	Ref. 00343 s/steel M1.0x4.5
Mobile Homecage	Neurotar
Multiphoton Laser Scanning Microscope	Olympus	FV1000MPE
Nonwoven swabs 5×5	Molnlycke Health Care	Mesoft	Surgical tampons
Polyacrylic glue	Henkel	Loctite 401
Round glass coverslip	Electron Microscopy Sciences
1.5 thickness
Small animal stereotaxic instrument	David Kopf Instruments	900
Student iris scissors, straight 11.5 cm	FST	91460-11
Xylazine	Bayer Health Care	Rompun vet