Sondering Høy tetthet funksjonelt protein Mikromatriser å oppdage Protein-protein interaksjoner

Summary

Ved hjelp av protein microarrays inneholder nesten hele S. cerevisiae proteom blir undersøkt for rask objektiv avhør av tusenvis av protein-protein interaksjoner i parallell. Denne metoden kan benyttes for protein-lite molekyl, posttranslasjonell modifikasjon, og andre assays i high-throughput.

Abstract

Høy tetthet funksjonelle protein microarrays inneholder ~ 4200 rekombinante gjær proteiner blir undersøkt for kinase protein-protein interaksjoner ved bruk av en affinitetsrenset gjær kinase fusjonsprotein som inneholder en V5-epitop tag for avlesning. Renset kinase oppnås gjennom kultur av en gjærstamme som er optimalisert for høyt kopiproteinproduksjon huse et plasmid som inneholder en kinase-V5-fusjonskonstruksjon som under en GAL-induserbar promoter. Den gjær dyrkes i media restriktive med en nøytral karbonkilde i 6 timer, fulgt av induksjon med 2% galaktose. Deretter blir kulturen høstet og kinase ble renset ved hjelp av affinitets-standard kromatografiske teknikker for å oppnå et høyt renset protein kinase for anvendelse i analysen. Det rensede kinase fortynnes med kinasebuffer til et passende område for analysen og protein microarrays blokkeres forut for hybridisering med proteinet microarray. Etter hybridisering, blir arrays probet med monoklonale V5 Antibody for å identifisere proteiner som er bundet av den kinase-V5 protein. Til slutt blir de arrays skannet ved bruk av en standard microarray scanner, og data blir ekstrahert for nedstrøms informatics analyse ^1,2 for å bestemme en høy tillit sett av protein interaksjoner nedstrøms for validering in vivo.

Introduction

Behovet for å utføre globale analyser av protein biokjemi og bindende aktivitet in vivo har resultert i utviklingen av nye metoder for profilering protein-protein interaksjoner (PPI) og post-translasjonelle modifikasjoner av hele proteom ^1,3-8. Protein mikromatriser er produsert som funksjonelle protein microarrays bruker helaftens funksjonelle proteiner ^4-6,8,9 eller analytiske protein microarrays inneholder antistoffer ^10,11. De er konstruert for å inneholde en høy tetthet av proteiner oppstilt på objektglass med en variasjon av overflatekjemi for å lette en rekke eksperimentelle betingelser som kreves for å gjennomføre omfattende biokjemiske analyser ^12. Nitrocellulose og aldehyd overflatekjemi for kjemisk vedlegg gjennom lysin eller affinitet festemetoder som nikkel- chelated lysbilder for å feste His-tagget proteiner og glutation for tilhørighet vedlegg blant andre ^13. </p>

Bruk av funksjonelle protein mikromatriser å påvise protein-protein interaksjoner krever tilgang til en høy kvalitet funksjonelt protein-bibliotek ^14. S. cerevisiae er mottagelig for å produsere et slikt bibliotek gjennom sammenkobling av high-kopi affinitet merket protein konstruksjoner med høy gjennomstrømming kromatografisk renseteknikker. Det store flertallet av gjær genomet har blitt sekvensert og nesten hele proteom- kan uttrykkes fra en høy-kopiplasmid for rensing og biokjemiske analyser ^12. Når proteiner er innhentet og kledd i 384-brønners format, de skrives ut på et objektglass slik at for rask parallell multi-parametrisk biokjemisk analyse og bioinformatiske avhør ^8,14-16. Protein mikromatriser har vært brukt for enzymatiske analyser og interaksjoner med proteiner, lipider, små molekyler, og nukleinsyrer blant mange andre anvendelser. Tilgjengeligheten av proteiner på overflaten av proteometarrays gjøre dem mottagelig for forskjellige typer av analytisk påvisning inkludert, immun-affinitet, overflate-plasmonresonans, fluorescens og mange andre teknikker. Dessuten gir det mulighet for god kontroll av den eksperimentelle tilstand der det kan være vanskelig å gjøre in vivo.

Målet med denne protokollen er å demonstrere riktig bruk av funksjonelle protein microarrays å påvise protein-protein interaksjoner. Dette programmet gjør det mulig for høy gjennomstrømming parallelt biokjemisk analyse av proteinbinding aktiviteter ved hjelp av et høyt renset analytt (protein) av interesse. En C-terminal (karboksy-terminal) merket V5-fusjonsprotein agn av interesse produseres fra en høy-kopi-plasmid i en gjærstamme som er optimalisert for proteinrensing. C-terminal merking sikrer at full-lengde protein er blitt oversatt. Proteinet anvendt i denne studien er Tda1-V5-fusjonsprotein kinase, som renses ved hjelp av nikkel affinitet harpiks via en His6X tag. Den Tda1-V5 fusion bygt er renset gjennom serie eluering med et imidazol gradient for å eluere det meste sterkt anriket fraksjon for anvendelse i analysen.

Protocol

1. Probe Forberedelse Kulturen og rense V5-kinase-fusjons sonder som brukes til å undersøke interaksjoner med andre proteiner som følger: Bruk fersk stripete gjærstamme Y258 (Mata pep4-3, his4-580, ura3-53, leu2-3,112) inneholder V5-fusjonsprotein (uttrykt fra Gateway vektor Pyes-DEST52). Bruk isolerte protein som probe på mikromatriser. Plate gjær på syntetisk komplett-uracil (Sc-Ura) / 2% dekstrose / Agar og vokse ved 30 ° C i 3 dager fra frossen kultur (-80 ° C glyserol lager). …

Representative Results

Den protein-protein interaksjon aktivitet ble observert ved anvendelse av en standard brikke leser for å evaluere Tda1-V5 protein kinase-fusjonskonstruksjon som et agn protein mot en gjær-funksjonelt protein mikromatrise inneholdende omtrent 4200 unike S. cerevisiae GST-fusjonsproteiner. Ytterligere avhør med Genepix programvare avdekket en rekke bindende hendelser av varierende intensitet. Affiniteten ble avleses fra gradert intensiteten av signalet som utledes fra et monoklonalt V5-fluorofor konjugert anti…

Discussion

Protokollen present ble opprinnelig utført ved hjelp av 85 unike gjær protein kinase-V5 fusjonsproteiner å sammenligne bindingsaktivitet over distinkte og beslektede familier av gjær proteinkinaser resulterer i identifisering av nye kinase interaksjons nettverk in vivo ^1. Som en voksende proteomikk profilering teknologi, utvikling av høy gjennomstrømning (HTP) screening av proteom bruker protein microarrays stolt på peptid biblioteker og eukaryote og prokaryote modellorganismer ^{8,17;</sup…}

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Petri Dishes	VWR	NC-10747	or comparable
Bacto yeast extract	Difco	0217-17
Bacto peptone	Difco	0118-17
Bacto agar	Difco	0140-01
Dextrose	Sigma	D9434
Raffinose	Sigma	R0514
Galactose	Sigma	G0750
Sc-Ura drop out media	MP Bio	114410622
Small Culture tubes	VWR/Fisher
Large Erlenmeyer Flask	VWR/Fisher
Centrifuge JA-10 rotor
Centrifuge tubes (500 mL)
Falcon tube (50 mL)	VWR/Fisher	21008-951
PBS Tablets	Sigma	P4417
FastPrep Tubes(2ml screw cap tube)
FastPrep Machine	MP Biomedicals	116004500
Zircon Beads	BioSpec	11079105
Triton X100	Sigma	P4417
DTT	Sigma	D9779
MgCl2	Sigma	M8266
NaCl	Sigma	S3014
Imidazole (pH = 7.4)	Sigma	I5513
PMSF	Sigma	93482
Complete Inhibitor Cocktail (EDTA Free)	Roche	11873580001
Phosphatase inhibitor cocktail 1	sigma	P2850
BSA	Sigma	A2153
Tween-20	Sigma	P1379
ATP	Sigma	A1852
Shaking Incubator (30 °C)
Nickel Affinity Resin	Life Technologies	R901-01
G25 column	GE life sciences	27-5325-01
Nutator	VWR/Fisher
SDS-PAGE Gel (NuPage)	Life Technologies
Coomassie Blue Stain	Life Technologies
Monoclonal V5 Antibody	Life Technologies	R960-25
Alexa647 Tagged monoclonal V5 Antibody	Life Technologies	451098
Protein Microarrays Kit	Life Technologies	PAH0525013
Genepix Scanner	Molecular Devices
Lifter Slips	Thomas Scientific		http://www.thomassci.com/Supplies/Microscope-Cover-Glass/_/LIFTER-SLIPS/
Lysis Buffer: 0.1% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 mM imidazole (pH 7.4), Complete protease inhibitor cocktail – EDTA-free, Phosphatase inhibitor Cocktail 1, 1 mM PMSF  (add just prior to use)			Add the reagents to 1 X PBS (0.01 M phosphate buffer, 0.0027 M potassium chloride, 0.137 M sodium chloride; pH 7.4) to obtain the desired volume of lysis solution
Blocking Buffer: 1% bovine serum albumin (BSA), 0.1% Tween-20			Add the reagents to 1 X PBS to obtain the desired volume of blocking buffer
Probe Buffer: 2 mM MgCl2, 0.5 mM DTT, 0.05% Triton X-100, 50 mM NaCl,500 μM ATP (for kinases), 1% BSA			Add the reagent to 1 X PBS to obtain desired volume of probe buffer
Wash Buffer: 0.1% Triton X-100, 500 mM NaCl, 0.5 mM DTT, 50 mM imidazole (pH 7.4),2 mM MgCl2			Add the reagent to 1 X PBS to obtain desired volume of probe buffer
Elution Buffer: 0.1% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 – 500 mM imidazole (pH 7.4), Complete protease inhibitor cocktail – EDTA-free, Phosphatase inhibitor Cocktail 1, 1 mM PMSF (add just prior to use)			Before you begin, it is important to note the concentration gradient of imidazole (50 – 500 mM) and to create separate tubes for each concentration (it is advisable to create the interval using 50 mM increments). Add the reagent to 1 X PBS to obtain desired volume of probe buffer
3x YEP +6% galactose: Dissolve 30 g of yeast extract and  60 g of peptone in 700 ml of H2O, and autoclave. Add 300 ml of filter sterilized 20% galactose (wt/vol)			galactose should not be autoclaved