Introduction
पोषक तत्वों और विषैले पदार्थ के तेज और वितरण जोरदार संयंत्र विकास प्रभावित करते हैं. तदनुसार, अंतर्निहित परिवहन प्रक्रियाओं की जांच विशेष रूप से पोषण अनुकूलन और पर्यावरणीय तनाव के संदर्भों में, संयंत्र जीव विज्ञान में अनुसंधान और कृषि विज्ञान 1,2 के एक प्रमुख क्षेत्र का गठन किया है (जैसे, नमक तनाव, अमोनियम विषाक्तता). पौधों में अपशिष्टों की माप के लिए तरीकों के बीच मुख्य काफी 1950 के दशक में विकसित किया गया था जो रेडियोआइसोटोपिक ट्रेसर, का उपयोग और आज व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाता है (3, उदा देखें). ऐसे MIFE (प्रवाह अनुमान आयन microelectrode) और एस आई इ टी (स्कैनिंग आयन चयनात्मक इलेक्ट्रोड तकनीक), और के उपयोग के रूप में इस तरह के ऊतकों में जड़ मध्यम और / या संचय, आयन चयनात्मक हिल microelectrodes के उपयोग से पोषक तत्व की कमी की माप के रूप में अन्य तरीकों, आयन चयनात्मक फ्लोरोसेंट रंगों, भी व्यापक रूप से लागू कर रहे हैं, लेकिन नेट फ्लू का पता लगाने के लिए अपनी क्षमता में सीमित कर रहे हैंXES (यानी, बाढ़ और तपका के बीच अंतर). radioisotopes का उपयोग करते हैं, दूसरी ओर, शोधकर्ता गतिज मापदंडों को हल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जो यूनिडायरेक्शनल अपशिष्टों को अलग और यों अद्वितीय क्षमता है, की अनुमति देता है (उदाहरण के लिए, कश्मीर मीटर और वी मैक्स), और क्षमता में अंतर्दृष्टि प्रदान, ऊर्जा, परिवहन व्यवस्था के तंत्र, और विनियमन,. रेडियोअनुरेखक साथ बनाया यूनिडायरेक्शनल प्रवाह माप विपरीत दिशा में प्रवाह अधिक है जहां शर्तों के तहत विशेष रूप से उपयोगी हैं, और intracellular पूल का कारोबार तेजी से 4. पता लगाया आइसोटोप एक ही तत्व की एक और आइसोटोप की एक पृष्ठभूमि के खिलाफ मनाया जाता है क्योंकि इसके अलावा, radiotracer तरीकों, (नीचे, 'चर्चा' देखें) माप कई अन्य तकनीकों के विपरीत, काफी उच्च सब्सट्रेट सांद्रता के तहत आयोजित करने की अनुमति दे.
यहाँ, हम यूनिडायरेक्शनल और एन के रेडियोआइसोटोपिक माप के लिए विस्तृत कदम प्रदानबरकरार पौधों में ईटी खनिज पोषक तत्वों की अपशिष्टों और विषैले पदार्थ. जोर प्रवाह पोटेशियम (K +) की माप, एक संयंत्र macronutrient 5, और अमोनिया / अमोनियम पर किया जाएगा (एनएच 3 / एनएच 4 +), तथापि, जैसे उच्च सांद्रता (पर जब वर्तमान विषैला होता है जो एक और macronutrient, 1 10 मिमी) 2. हम radioisotopes 42 + K (टी 1/2 = 12.36 घंटा) और 13 राष्ट्रीय राजमार्ग 3/13 एनएच 4 + टी (1/2 = 9.98 मिनट), क्रमशः, मॉडल प्रणाली जौ की अक्षुण्ण पौध में (Hordeum vulgare एल का प्रयोग करेंगे .), दो प्रमुख प्रोटोकॉल का विवरण में: ट्रेसर तपका (श्रेणियों) द्वारा प्रत्यक्ष बाढ़ (डीआई) और पूरक विश्लेषण. हम इस लेख बस एक प्रोटोकॉल प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक कदम का वर्णन करता है कि शुरू से ध्यान देना चाहिए. प्रत्येक तकनीक का जहां उपयुक्त हो, गणित और सिद्धांत का संक्षिप्त विवरण प्रदान की है, लेकिन विस्तृत कर रहे हैं प्रदर्शनियोंपृष्ठभूमि और सिद्धांत विषय 4,6-9 पर कई महत्वपूर्ण लेख में पाया जा सकता है. महत्वपूर्ण बात है, इन प्रोटोकॉल अन्य पोषक तत्वों / विषैले पदार्थ के विश्लेषण के प्रवाह के लिए मोटे तौर पर हस्तांतरणीय हैं (उदाहरण के लिए, 24 ना +, 22 ना +, 86 आरबी +, 13 नं 3 -) और अन्य प्रजातियों के पौधे को, कुछ निरंतर साथ यद्यपि (नीचे देखें) . हम भी रेडियोधर्मी सामग्री के साथ काम कर रहे सभी शोधकर्ताओं उनकी संस्था के विकिरण सुरक्षा नियामक के माध्यम से व्यवस्था एक लाइसेंस के तहत काम करना चाहिए कि महत्व पर जोर.
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Protocol
1 संयंत्र संस्कृति और तैयारी
- (विवरण के लिए, 10 देखें) एक जलवायु नियंत्रित विकास कक्ष में 7 दिनों के लिए जौ पौध हाइड्रोपोनिकली आगे बढ़ें.
नोट: यह पोषक आवश्यकताओं उम्र के साथ बदल जाएगा, के रूप में विकास के चरणों की एक किस्म पर पौधों की जांच पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है. - एक दिन पहले प्रयोग करने के लिए, एक भी दोहराने (डि लिए बंडल प्रति 3 पौधों, श्रेणियों के लिए बंडल प्रति 6 पौधों) बनाने के लिए एक साथ कई पौध बंडल. शूटिंग के बेसल हिस्से के चारों ओर Tygon टयूबिंग की एक 2 सेमी टुकड़ा लपेटकर, और एक "कॉलर" बनाने के लिए टेप के साथ ट्यूबिंग प्राप्त करके बंडल पौध.
नोट: बंडल प्रति पौधों की संख्या प्रयोगात्मक शर्तों 10,13,14 के आधार पर भिन्न हो सकते हैं. Bundling जड़ जन और / या विशिष्ट गतिविधि कम कर रहे हैं, खासकर जब सांख्यिकी और माप सटीकता में सुधार करने के लिए किया जाता है.
प्रायोगिक समाधान / माल की 2. तैयारी
सामग्री "> नोट: निम्न आम तौर पर पूर्व प्रयोग करने के लिए 1 दिन किया जाता है.- , और संयंत्र सामग्री और विशिष्ट गतिविधि [एस ओ के लिए नमूना शीशियों ((संयंत्र नमूनों की स्पिन सुखाने के लिए), centrifugation ट्यूब (11 देखते हैं, जानकारी के लिए) पूर्व लेबलिंग, लेबलिंग, और desorption समाधान;: डि लिए निम्न इकट्ठा नीचे देखें]). Aerate और सभी समाधान मिश्रण.
- , (10 देखते हैं, जानकारी के लिए) eluates, संयंत्र के नमूने लिए तपका फ़नल, (संयंत्र नमूनों की स्पिन सुखाने के लिए) centrifugation ट्यूबों, और नमूना शीशियों (खैर मिश्रित, वातित लेबलिंग और क्षालन समाधान, और: श्रेणियों के लिए निम्न इकट्ठा एस ओ और कमजोर पड़ने कारक के निर्धारण [डी एफ, नीचे देखें]).
3 radiotracer तैयार
चेतावनी: निम्न सुरक्षा कदम रेडियोधर्मिता के साथ काम करने से पहले लिया जाना चाहिए.
- सुनिश्चित करें कि Radioac की आवश्यकताओंसक्रिय सामग्री लाइसेंस समझा और पीछा कर रहे हैं. उचित सुरक्षा उपकरणों (यानी, चश्मे, दस्ताने, प्रयोगशाला कोट, नेतृत्व बनियान / कॉलर) और dosimeters (जैसे, टीएलडी अंगूठी और बिल्ला) पहनें. परिरक्षण सेट अप (यानी, Plexiglas और नेतृत्व ईंटों) और इसके पीछे रेडियोधर्मी काम करते हैं. एक Geiger-मुलर काउंटर नियमित संदूषण के लिए नजर रखने के लिए आदेश में मौजूद है कि सुनिश्चित करें.
- 42 कश्मीर की तैयारी +
- संतुलन पर एक साफ, सूखे बीकर रखें. शेष शून्य.
- पैकेजिंग से (पाउडर के रूप में 42 कश्मीर 2 सीओ 3 से 20 एमसीआई) दरियाफ्त की शीशी निकालें और बीकर में दरियाफ्त डालना. जन का ध्यान रखना.
- बीकर में एच 2 एसओ 4 का 0.07 मिलीग्राम द्वारा पीछा DH 2 हे के पिपेट 19.93 मिलीलीटर,,. यह निम्न रासायनिक प्रतिक्रिया ड्राइव करेंगे:
42 कश्मीर 2 सीओ 3 (एस) + एच 2 एसओ 4 (एल) + एच 2 ओ (एल) 42 → 2> इतनी 4 (एल) + सीओ 2 (वी) + 2H 2 ओ (एल) - कश्मीर 2 सीओ 3 के द्रव्यमान और आणविक वजन दिया रेडियोधर्मी स्टॉक समाधान की एकाग्रता, और मात्रा (20 एमएल) की गणना.
नोट: 13 एनएच 3/13 एनएच 4 + ट्रेसर पानी की ऑक्सीजन परमाणु के प्रोटॉन बमबारी के माध्यम से एक साइक्लोट्रॉन में उत्पादन किया है के साथ काम कर रहे हैं (आमतौर पर 100-200 एमसीआई गतिविधि में जिसके परिणामस्वरूप, उत्पादन जानकारी के लिए, 12 देखें). 14 एनएच 3/14 एनएच 4 + की मात्रा इन समाधानों में बेहद कम है, क्योंकि शेयर समाधान के एन एकाग्रता नगण्य है.
4 सीधी बाढ़ (डीआई) मापन
- 42 + K के लिए, लेबलिंग समाधान में कश्मीर + के वांछित अंतिम एकाग्रता तक पहुँचने के लिए आवश्यक रेडियोधर्मी शेयर समाधान की राशि पिपेट.
- एनएच 3/13 13 के लिए एनएच 4 +, पिपेट लेबलिंग समाधान में एक छोटी राशि (<0.5 मिलीलीटर). लेबलिंग समाधान (वातन के माध्यम से) मिश्रण अच्छी तरह से करने की अनुमति दें.
- एक नमूना शीशी में लेबलिंग समाधान के 1 मिलीलीटर उप नमूना पिपेट और (कुल 4 नमूने) तीन बार दोहराएँ.
- एक गामा काउंटर का उपयोग कर, ("प्रति मिनट मायने रखता है", सीपीएम में) शीशियों में रेडियोधर्मिता मापने. (इस तरह के अल्पकालिक tracers के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है) काउंटर सीपीएम रीडिंग समस्थानिक क्षय के लिए सही कर रहे हैं कि इस तरह के प्रोग्राम है कि सुनिश्चित करें.
- चार नमूनों की मायने रखता है (सीपीएम मिलीलीटर -1) के औसत और (μmol मिलीलीटर -1) समाधान में सब्सट्रेट की एकाग्रता द्वारा विभाजित करके (सीपीएम μmol -1 के रूप में व्यक्त) एस ओ की गणना.
- देखते हैं (परीक्षण परिस्थितियों में पौधों पूर्व संतुलित करने के लिए, 5 मिनट के लिए पूर्व लेबलिंग (गैर रेडियोधर्मी) समाधान में जड़ों विसर्जितजैसे, पूर्व लेबल समय में बदलाव के लिए 10,13,14).
- 5 मिनट के लिए लेबलिंग (रेडियोधर्मी) समाधान में जड़ों को विसर्जित कर दिया.
नोट: लेबल बार प्रयोग 3,4,7-10 के आधार पर भिन्न हो सकते हैं. - सतह से पालन रेडियोधर्मिता के थोक हटाने के लिए 5 सेकंड के लिए desorption समाधान करने जड़ों स्थानांतरण. बाह्य ट्रेसर के आगे स्पष्ट जड़ों को 5 मिनट के लिए desorption समाधान के लिए एक दूसरे बीकर में जड़ों स्थानांतरण.
- अलग गोली मारता है, बेसल गोली मारता है, और जड़ों को काटना और.
- एक कम गति में 30 सेकंड के लिए अपकेंद्रित्र ट्यूबों में जड़ों और स्पिन नमूने रखें, नैदानिक ग्रेड अपकेंद्रित्र (~ 5000 XG) सतह और बीचवाला पानी को निकालने के लिए.
- जड़ों (ताजा वजन, परिवार कल्याण) वजन.
- संयंत्र के नमूने में रेडियोधर्मिता गणना (शूट, बेसल गोली मार, और जड़; कदम 4.2.1 देखें).
- प्रवाह की गणना. सूत्र का उपयोग संयंत्र में बाढ़ की गणना
Φ = क्यू * / एस ओ WT एल
जहां Φ प्रवाह है(Μmol जी -1 घंटा -1), क्यू * ऊतकों में जमा दरियाफ्त की मात्रा (आमतौर पर जड़ में, शूट, सीपीएम, और, संयुक्त बेसल शूट), एस ओ लेबलिंग समाधान (सीपीएम μmol की विशिष्ट गतिविधि है - 1), डब्ल्यू जड़ ताजा वजन (ग्राम) है, और टी एल लेबलिंग समय (घंटा) है.
नोट: और अधिक परिष्कृत गणना श्रेणियों से प्राप्त मानकों पर आधारित, लेबलिंग और desorption दौरान जड़ों से एक साथ ट्रेसर तपका के लिए खाते में बनाया जा सकता है (; जानकारी के लिए, 4 देखें नीचे देखें).
अनुरेखक तपका (श्रेणियों) मापन द्वारा 5 पूरक विश्लेषण
- लेबलिंग समाधान और उपाय एस ओ (- ऊपर, 4.2 कदम 4.1 देखें) तैयार करें.
- कमजोर पड़ने कारक (डी एफ) उपाय.
नोट: अक्सर, गामा काउंटर में डिटेक्टर के लिए नमूना रिश्तेदार की स्थिति मात्रा को प्रभावित कर सकते हैंविकिरण का मापा. विवरण के लिए चर्चा देखें.- एस ओ को मापने के बाद, प्रत्येक नमूने के ओ 2 एच के 19 मिलीलीटर जोड़ने (जैसे कि अंतिम मात्रा = eluate मात्रा = 20 मिलीलीटर). प्रत्येक 20 मिलीलीटर नमूने में रेडियोधर्मिता गणना (कदम 4.2.1 देखें).
- 20 मिलीलीटर नमूने की औसत सीपीएम द्वारा 1 मिलीलीटर नमूने की औसत सीपीएम विभाजित करके डी एफ गणना.
- 1 घंटे के लिए लेबलिंग समाधान में जड़ों को विसर्जित कर दिया.
- सभी रूट सामग्री कीप के भीतर है, यह सुनिश्चित करना कीप तपका के लिए लेबलिंग समाधान और स्थानांतरण पौधों से पौधों को निकाल दें. प्लास्टिक कॉलर पर टेप की एक छोटी सी पट्टी लगाने से तपका कीप की ओर धीरे सुरक्षित पौधों.
- धीरे कीप में पहली eluate डालना. टाइमर शुरू (गिनती).
- पानी की कल खोलें और 15 सेकंड के बाद नमूना शीशी में eluate इकट्ठा (नोट: क्षालन समय पर अलग अलग होंगे, नीचे देखें). पानी की कल बंद करें. धीरे कीप में अगले eluate डालना.
- Repeaपहले से अंतिम eluate के लिए, जो इस प्रकार क्षालन श्रृंखला के शेष के लिए टी कदम 5.6: 15 सेकंड (चार बार), 20 सेकंड (तीन बार), 30 सेकंड (दो बार), 40 सेकंड (एक बार), 50 सेकंड (एक बार), 29.5 मिनट की कुल क्षालन अवधि के लिए 1 मिनट (25 बार),
नोट: Desorption श्रृंखला प्रयोगात्मक शर्तों 7-10,13,14 के आधार पर भिन्न हो सकते हैं. - क्षालन प्रोटोकॉल पूरा हो गया है एक बार, फसल पौधों (- ऊपर 4.8, 4.6 कदम).
- (5.2 देखना, डी एफ द्वारा प्रत्येक eluate के लिए पढ़ने गुणा) गामा काउंटर में eluates और संयंत्र के नमूने में रेडियोधर्मिता की गणना.
- क्षालन समय के एक समारोह के रूप में प्लॉट ट्रेसर रिलीज (सीपीएम जी (जड़ परिवार कल्याण) -1 मिनट -1). स्थिर राज्य की स्थिति के लिए, रेखीय प्रतिगमन और अपशिष्टों की गणना, विनिमय का आधा जीवन, और पूल आकार (विवरण के लिए, 6-9 देखें) प्रदर्शन करते हैं.
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Representative Results
चित्रा 1 उच्च से बढ़ी बरकरार जौ की पौध की जड़ों में एनएच 3 की आमद के लिए (13 एन) के साथ डि तकनीक का उपयोग कर पाया isotherms, से पता चलता है (10 मिमी) एनएच 4 +, और या तो (0.02 मिमी) कम या उच्च (5 मिमी ) + K. (; समाधान पीएच 13 में परिवर्तन कर एडजस्ट [एनएच 3] ext) एनएच 3 अपशिष्टों बाहरी एनएच 3 एकाग्रता के एक समारोह के रूप में प्लॉट किए जाते हैं जब isotherms Michaelis-Menten कैनेटीक्स प्रदर्शित करते हैं. एनएच 3 अपशिष्टों उच्च कश्मीर + की तुलना में कम + K में काफी अधिक थे. Michaelis-Menten गतिज मापदंडों का विश्लेषण वी मैक्स जोरदार उच्च + K (205 बनाम पर कम हो जाता है, जबकि कश्मीर मीटर, कश्मीर + स्तर (क्रमशः निम्न और उच्च + K, पर 150 बनाम 90 μ एम) के बीच अपेक्षाकृत स्थिर बनी हुई है कि पता चला 80 μmol जी -1 घंटा -1). इस प्रकार, डेटा से संकेत मिलता है कि कश्मीर + स्तर regulatतों नाइट्रोजन परिवहन (वी अधिकतम प्रभाव), लेकिन नहीं ट्रांसपोर्टरों की बाध्यकारी साइटों के लिए कश्मीर + और एनएच 3 के बीच सीधी प्रतिस्पर्धा (कश्मीर मीटर प्रभाव) से. बल्कि, कश्मीर + (विवरण के लिए, 13 देखें) एनएच ऐसे aquaporin गतिविधि के मॉडुलन के माध्यम के रूप में अन्य तरीकों से 3 अपशिष्टों, विनियमित सकता है.
डि कारण पोषाहार बदलाव को भी बाढ़ में अपेक्षाकृत तेजी से परिवर्तन के कब्जा करने के लिए उपयोगी है, या औषधीय एजेंटों के आवेदन करने के लिए. उदाहरण के लिए, चित्रा 2 पर प्रकाश डाला गया -K + (0.1 मिमी) मध्यम और उच्च (10 मिमी) से बढ़ी बरकरार जौ की पौध की जड़ों में कश्मीर + -uptake प्रणाली का तेजी प्लास्टिसिटी -NH 4 + की स्थिति. यहाँ, हम बाहरी समाधान से एनएच 4 + वापसी के 5 मिनट के भीतर + K बाढ़ में एक ~ 350% वृद्धि मनाया. यह "अमोनियम वापसी प्रभाव" ("एडब्ल्यूई") + K के प्रति संवेदनशील होना पाया गया +), बेरियम (बा 2 +), और सीज़ियम (सीएस). कई Arabidopsis जीनोटाइप में डि और electrophysiological माप का उपयोग करना, हम करने में सक्षम थे निर्णायक Arabidopsis + K चैनल, AtAKT1, और उच्च आत्मीयता + K ट्रांसपोर्टर, AtHAK5 14 की गतिविधियों में परिवर्तन करने के लिए खौफ का विशाल बहुमत मानो.
चित्रा 3 भूखंडों कम (0.1 मिमी) + K और (1 मिमी) मध्यम से बढ़ी पूर्व लेबल जौ की पौध की जड़ों से समय के साथ 42 + K के स्थिर राज्य तपका, कोई 3 -. ये निशान श्रेणियों विधि विभिन्न औषधीय / पोषण एजेंटों के आवेदन पर तपका में तेजी से और महत्वपूर्ण परिवर्तन प्रकट कर सकते हैं कि कैसे दिखा. + K तपका का पर्याप्त, तत्काल निषेध 10 मिमी सी + एक + K चैनल ब्लॉकर, या तेजी से वृद्धि का एक आवेदन या तो पर मनाया गया(0.1 से 10 मिमी के लिए) + K प्रावधान में. इन परिणामों + K चैनल 15 जावक सुधार की अनूठी gating गुणों का वर्णन आणविक पढ़ाई के साथ संगत कर रहे हैं. इसके विपरीत, 10 मिमी एनएच 4 के आवेदन तेजी से और दृढ़ता + K तपका प्रेरित +. इस आशय एनएच 4 + 17 की शुरूआत पर होने के लिये जाना जाता है जो जड़ कोशिकाओं 16, की प्लाज्मा झिल्ली भर में विद्युत क्षमता ढाल की विध्रुवण के माध्यम से जावक सुधार + K चैनलों की सक्रियता से समझाया जा सकता है. इस प्रकार, इस पद्धति का उपयोग करके, हम कश्मीर + चैनलों जौ 10 की जड़ों में कश्मीर + तपका कि मध्यस्थता, Planta में, प्रदर्शित करने के लिए सक्षम है.
अन्त में, 1 टेबल 42 + K तपका ([+ K] ext = 0.1 मिमी) जौ बीज में स्थिर राज्य के माप से निकाला श्रेणियों मापदंडों से पता चलता हैया 10 मिमी एनएच 4 +, बाद एक जहरीले परिदृश्य का प्रतिनिधित्व - Lings या तो 1 मिमी सं 3 के साथ हो गई. उच्च एनएच 4 + हालत सभी + K अपशिष्टों के दमन, और साइटोसोलिक + K एकाग्रता में एक महत्वपूर्ण गिरावट के बारे में लाता है ([+ K] CYT) मनाया के रूप में सामान्य रूप से homeostatically (स्वस्थ विकास की स्थिति 18 के तहत ~ 100 मिमी पर बनाए रखा है, जो , जैसे, 1 टेबल में, कोई 3 के तहत - आपूर्ति).
चित्रा 1 13 एनएच 3 तांता isotherms + K आपूर्ति नाइट्रोजन परिवहन को नियंत्रित कैसे प्रकट करते हैं. एनएच 3 तांता राष्ट्रीय राजमार्ग के बाहरी सांद्रता बदलती के एक समारोह के रूप में 4 + और (लाल 0.02 मिमी,) कम या (नीला, 5 मिमी) उच्च या तो कश्मीर + उच्च (10 मिमी) राष्ट्रीय राजमार्ग 3 से बढ़ी जौ की पौध की अक्षुण्ण जड़ों में> 3 ([एनएच 3] ext). Michaelis-Menten उच्च + K प्रावधान एनएच 3 -uptake ट्रांसपोर्टरों की सब्सट्रेट आत्मीयता (यानी, कश्मीर मीटर) पर अपेक्षाकृत कम प्रभाव पड़ता है, लेकिन काफी (यानी, वी मैक्स परिवहन क्षमता को कम कर देता है कि प्रकट isotherms का विश्लेषण करती है, 'प्रतिनिधि परिणाम देखना '). हेंडरसन-Hasselbalch समीकरण के अनुसार, एनएच 4 + अनुपात: नोट, [एनएच 3] ext में परिवर्तन इस प्रकार एनएच 3 NaOH के साथ बाहरी समाधान पीएच स्थानांतरण द्वारा स्थापित किया गया और. त्रुटि सलाखों 4-7 के SEM replicates संकेत मिलता है. (Coskun एट अल से reproduced. व्यर्थ transmembrane साइकिल चालन के लिए रैपिड अमोनिया गैस परिवहन खातों राष्ट्रीय राजमार्ग के तहत पौधे की जड़ों में 3 / एनएच 4 + विषाक्तता. प्लांट Physiol. 163, 1859-1867 (2013).)
चित्रा 2 एनएच 4 + वापसी काफी कम (0.1 मिमी) + K और उच्च से बढ़ी बरकरार जौ की पौध की जड़ों में, स्थिर राज्य में. + K बाढ़ चैनल की मध्यस्थता + K बाढ़ को उत्तेजित करता है, और एनएच 4 + की वापसी पर (10 मिमी) एनएच 4 +. उत्तेजित + K आमद पर कश्मीर + चैनल ब्लॉकर्स (10 मिमी चाय +, 5 मिमी बा 2 +, और 10 मिमी सी +) का प्रभाव स्पष्ट है. एक तरह से एनोवा साथ Dunnett के कई तुलना के बाद हॉक, तारों * 0.01 <पी <0.05, *** पी <0.001 -NH 4 + और उपचार जोड़े (बीच में महत्व के विभिन्न स्तरों को निरूपितटेस्ट). कोष्ठक में तारों नियंत्रण और -NH 4 जोड़ी (छात्र के टी -test) के बीच महत्व के स्तर निरूपित. त्रुटि सलाखों> 4 प्रतिकृति के SEM से संकेत मिलता है. (जौ और Arabidopsis. प्लांट Physiol. 162, 496-511 (2013) की जड़ों में Coskun एट अल. क्षमता और पोटेशियम चैनलों और उच्च आत्मीयता ट्रांसपोर्टरों के plasticity से reproduced.)
चित्रा 3 + K तपका चैनल की मध्यस्थता कम + K परिस्थितियों में है स्थिर राज्य (1 मिमी) कम (0.1 मिमी) + K और मध्यम से बढ़ी बरकरार जौ की पौध की जड़ों में 42 + K तपका सं 3 -., और (टी = 15.5 मिनट, तीर देखें) तत्काल प्रभाव 10 मिमी CsCl की, 5 मिमी कश्मीर 2 एसओ4, और 5 मिमी (एनएच 4) तपका पर 2 अतः 4. प्रत्येक भूखंड 3-13 प्रतिकृति (SEM <मतलब का 15%) का मतलब प्रतिनिधित्व करता है. (. Coskun एट अल नियमन और जौ जड़ों से पोटेशियम रिहाई के तंत्र से Reproduced:. Planta में एक 42 + K विश्लेषण नई Phytol 188, 1028-1038 (2010)..)
| [+ K] ext | एन स्रोत | बाढ़ | तपका | नेट फ्लक्स | ई: मैं अनुपात | पूल आकार | आधा जीवन |
| (मिमी) | (Μmol जी -1 घंटा -1) | (मिमी) | (मिनट) | ||||
| 0.1 | 1 नग 3 - | 7.22 ± 0.23 | 1.86 ± 0.18 | 5.36 ± 0.18 | 0.25 ± 0.02 | 98.84 ± 14.08 | 28.18 ± 3.40 |
| 10 एनएच 4 + | 1.89 ± 0.13 | 0.57 ± 0.05 | 1.32 ± 0.10 | 0.30 ± 0.01 | 28.39 ± 3.40 | 32.50 ± 4.69 | |
तालिका 1 स्थिर राज्य कश्मीर + अपशिष्टों और गविभिन्न एन प्रावधानों के तहत ompartmentation स्थिर राज्य प्रवाह और 0.1 मिमी + K से बढ़ी जौ की पौध की पूरक विश्लेषण, और या तो मध्यम सं 3 -. (1 मिमी, सीए 2 + नमक के रूप में) या उच्च एनएच 4 + (10 मिमी, तो के रूप में 4 2 नमक). त्रुटियाँ> 8 replicates के ± SEM से संकेत मिलता है. 1028-1038 (2010, 188 Planta में एक 42 + K विश्लेषण नई Phytol) और Coskun एट अल क्षमता और पोटेशियम चैनलों और के plasticity उच्च:... (Coskun एट अल नियमन और जौ जड़ों से पोटेशियम रिहाई के तंत्र से reproduced. जौ और Arabidopsis. प्लांट Physiol. 162, 496-511 (2013) की जड़ों में आत्मीयता ट्रांसपोर्टरों.)
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Discussion
उपरोक्त उदाहरण में प्रदर्शन के रूप में, radiotracer विधि Planta में पोषक तत्वों और विषैले पदार्थ की यूनिडायरेक्शनल अपशिष्टों को मापने का एक शक्तिशाली साधन है. 1 एनएच 3 तांता शायद जो 225 μmol जी -1 घंटा -1, से अधिक तक पहुँच सकते हैं कि पता चलता है उच्चतम सदाशयी transmembrane प्रवाह कभी एक संयंत्र प्रणाली 13 में सूचना दी, लेकिन केवल शुद्ध अपशिष्टों मापा गया यदि इस प्रवाह की भयावहता दिखाई नहीं होगा. एनएच 3 की एक बड़ी तपका लेबलिंग समय 13 के साथ बढ़ जाती है कि बाढ़ का एक स्पष्ट कम है में परिणाम कर सकते हैं कि एक व्यर्थ साइक्लिंग परिदृश्य में, बाढ़ के रूप में एक ही समय पर होता है, क्योंकि यह है. , 13 एन के दोनों बाढ़ और तपका electrophysiological विश्लेषण के साथ ट्रेसर तकनीक सप्लीमेंट द्वारा, हम चित्रा 1 की शर्तों के तहत है कि प्रदर्शन कर रहे थे मुख्यतः तटस्थ गैस के एनएच 3 है, और नहीं अपने conjug की+ (विवरण के लिए, 13 देखें) एसिड एनएच 4 खा लिया. इस जड़ों में तेजी से एनएच 3 गैस अपशिष्टों की Planta प्रदर्शन में पहला है, और इस तरह के रूप में, उच्च पौधों 2,13 में एनएच / एनएच 4 + विषाक्तता 3 के दिल में है कि परिवहन तंत्र unraveling की ओर महत्वपूर्ण प्रारंभिक सबूत उपलब्ध कराता है. Heterologous अभिव्यक्ति सिस्टम में आण्विक काम एनएच 3 हाल औषधीय सबूत के साथ, चित्रा 1 से पौधों 19, और डेटा में aquaporins के माध्यम से प्रवाह कर सकते हैं कि प्रदर्शन किया है, अक्षुण्ण जीव 13 के स्तर पर इस तरह के निष्कर्षों की पुष्टि करने के लिए शुरू हो गया है.
आंकड़े 2 और 3 में भी रेडियोअनुरेखक साथ यूनिडायरेक्शनल अपशिष्टों को मापने की उपयोगिता का उत्कृष्ट उदाहरण देते हैं. 42 + K साथ डि का उपयोग करना, हम + चैनलों स्थिर राज्य कश्मीर के लिए जिम्मेदार नहीं हैं कि आयन प्रदर्शित करने में सक्षम थे Arabidopsis 14 के विपरीत, कम + K और उच्च एनएच 4 से बढ़ी जौ की पौध की जड़ों में तेज. एनएच 4 + वापस ले लिया गया था केवल जब हम कश्मीर + चैनलों की सगाई (चित्रा 2) के लिए सबूत देखा था. (बढ़ा ऊतक + K सामग्री 14 से दिखाया गया है) + K का शुद्ध प्रवाह भी एनएच 4 + वापसी से प्रेरित है, यूनिडायरेक्शनल बाढ़ मापने केवल द्वारा हम सक्षम इस घटना की भयावहता और तेजी से शुरू होने प्रकट कर रहे थे. इसके अलावा, म्यूटेंट और औषधीय एजेंटों के साथ डि माप का आयोजन करके, हम शामिल थे जो परिवहन प्रोटीन की पहचान करने में सक्षम थे. इसी तरह, ट्रेसर तपका जबकि निगरानी (चित्रा 3) पोषण और औषधीय एजेंटों लागू करके, हम विशेषताएँ और जौ जड़ कोशिकाओं 10 से + K तपका के तंत्र की पहचान करने में सक्षम थे. ऐसे डि रूप में इस प्रकार, तकनीकऔर केट एक महत्वपूर्ण macronutrient के लिए परिवहन विशेषताओं की समझ के लिए महत्वपूर्ण भूमिका निभाई जा सकती है.
प्रोटोकॉल में वर्णित है, अक्सर गामा काउंटर में डिटेक्टर के लिए नमूना रिश्तेदार की स्थिति मापा विकिरण की मात्रा को प्रभावित कर सकते हैं. एक 1 मिलीलीटर नमूने एच 2 ओ के 19 मिलीलीटर के साथ "अव्वल" है इस प्रकार, यदि 20 मिलीलीटर नमूने में (सीपीएम) मापा मायने रखता है उसी मात्रा में होने के बावजूद, 1 मिलीलीटर नमूने में की तुलना में काफी कम किया जा सकता है radiotracer की. इसलिए, एक डी एफ रेडियोधर्मिता का यह स्पष्ट 'कमजोर पड़ने' के लिए सही करने के लिए लागू किया जा सकता है. यह समस्या अक्सर स्पष्ट रूप से पता लगाने के उपकरण के निर्माताओं से नहीं कहा गया है और व्यक्तिगत शोधकर्ता द्वारा बाहर काम किया जाना चाहिए. इसी तरह, (काउंटर के भीतर पास के नमूनों से यानी,) परिवेश विकिरण के खिलाफ डिटेक्टरों के भीतर परिरक्षण की प्रभावशीलता निर्माताओं द्वारा अतिरंजित किया जा सकता है, और इस तरह के मुद्दों पर काम किया जाना चाहिएव्यक्तिगत मापन प्रणाली के लिए बाहर.
ट्रेसर तकनीक का एक प्रमुख लाभ स्थिर राज्य शर्तों के तहत, अपशिष्टों, intracellular पूल आकार, और विनिमय दर को मापने के लिए एक साधन प्रदान करता है जो अपने गैर invasiveness है. उदाहरण के लिए, भोजन के साथ, हम गैर invasively + K (1 टेबल) के साइटोसोलिक सांद्रता यों सकता है. इस तरह के सेल को शारीरिक और संभवतः रासायनिक गड़बड़ी होती है जो आयन चयनात्मक microelectrodes 18 के साथ कोशिकाओं के कोंचना, के रूप में वैकल्पिक तरीकों के लिए बेहतर हो सकता है. इसके अलावा, ट्रेसर तकनीक यह पूरे अंगों और बरकरार पौधों के लिए अपशिष्टों और compartmentalization के लिए एक व्यापक दृष्टिकोण प्रदान करता है कि आप में अनूठा है. यह अंत में क्षेत्र में प्रदर्शन एक पूरे संयंत्र पोषक गतिशीलता, विषाक्तता को समझने में दिलचस्पी है तो महत्वपूर्ण है, और. अन्त में, radiotracer तरीकों बहुत संवेदनशील माप काफी उच्च सब्सट्रेट सांद्रता के तहत आयोजित किए जाने के लिए अनुमति देता है. परंपराराष्ट्रीय कमी प्रयोगों और microelectrode तकनीक पृष्ठभूमि हस्तक्षेप की समस्याओं का अनुभव कर सकते हैं और इस तरह, ब्याज की सब्सट्रेट के बाहरी एकाग्रता अच्छी तरह से विकास के दौरान प्रदान की है कि नीचे उतारा जाता है कि आवश्यकता हो सकती है. यह (; ऊपर देखें ऐसे एनएच 3 / एनएच 4 + विषाक्तता या "उच्च + K" शर्तों के साथ) के रूप में एक उच्च सब्सट्रेट सांद्रता के "स्थिर राज्य" की स्थिति का अध्ययन करने में रुचि रखता है तो समस्याग्रस्त हो सकता है.
यह सभी तकनीकों की तरह, रेडियोअनुरेखक साथ अपशिष्टों को मापने अपनी सीमाओं के बिना नहीं है, कि ध्यान दिया जाना चाहिए. उदाहरण के लिए, रेडियोअनुरेखक की उपलब्धता विशेष रूप से इस तरह के एक साइक्लोट्रॉन के रूप में एक उत्पादन सुविधा के पास की आवश्यकता है कि 13 एन की तरह बहुत कम रहता आइसोटोप के लिए, समस्याग्रस्त हो सकता है. एक अन्य प्रमुख सीमा समय में, यह झिल्ली भर में होने वाली हैं कि अपशिष्टों और उन से होने वाली extracel के बीच विभेद करने के लिए मुश्किल हो सकता हैlularly. इस तरह के भेद कठोर चरण 7,10,20 के परीक्षण के लिए कहते हैं. + K तपका के मामले में केवल सावधान परीक्षा के बाद जड़ों से 42 + K रिलीज उच्च में कोशिका झिल्ली के पार नहीं होने वाली थी कि स्थिर राज्य पुष्टि करने के लिए हम सक्षम थे [+ K] ext (> 1 मिमी) 10, लेकिन कोशिकी से रिक्त स्थान (CF, चित्रा 3). इस तरह के मुद्दों औषधीय एजेंटों की एक विस्तृत श्रृंखला के प्रभाव का परीक्षण करके हल किया जा सकता है, या खारा शर्तों के तहत सूचना दी बहुत अधिक ना + अपशिष्टों वे कोशिका झिल्ली भर में आगे बढ़ने के लिए गया energetically अव्यावहारिक होगा कि उदाहरण के लिए दिखाया गया है जो thermodynamic विश्लेषण,,, के माध्यम से 21,22.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gamma counter | Perkin Elmer | Model: Wallac 1480 Wizard 3" | |
| Geiger-Müller counter | Ludlum Measurements Inc. | Model 3 survey meter | |
| 400 ml glass beakers | VWR | 89000-206 | For pre-absorption, absorption, and desorption solutions |
| Glass funnel | VWR | 89000-466 | For efflux funnel |
| Large tubing | VWR | 529297 | For efflux funnel |
| Medium tubing | VWR | 684783 | For bundling |
| Small tubing | VWR | 63013-541 | For aeration |
| Aeration manifold | Penn Plax Air Tech | vat 5.5 | To control/distribute pressurized air into solutions |
| Glass scintillation vials | VWR | 66022-128 | For gamma counting |
| Glass centrifuge tubes | VWR | 47729-576 | For spin-drying root samples |
| Kimwipes | VWR | 470173-504 | For spin-drying root samples |
| Dissecting scissors | VWR | 470001-828 | |
| Forceps | VWR | 470005-496 | |
| Low-speed clinical centrifuge | International Equipment Co. | 76466M-4 | For spin-drying root samples |
| 1 ml pipette | Gilson | F144493 | |
| 10 ml pipette | Gilson | F144494 | |
| 1 ml pipette tips | VWR | 89079-470 | |
| 10 ml pipette tips | VWR | 89087-532 | |
| Analytical balance | Mettler toledo | PB403-S/FACT |
References
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